荧光假单胞菌脂肪酶的克隆表达、酶学性质及其在手性拆分中的应用研究

论文摘要

假单胞菌脂肪酶在催化酯水解、酯合成和酯交换反应中常常表现出很高的选择性,因此广泛应用于制药和农药等许多领域中。多年来的研究表明,假单胞菌脂肪酶基因在E. coli中的表达大多以没有活性的包涵体形式存在,这极大地限制了经济而高效的E. coli表达系统在其表达上的应用。本论文中我们采用PCR的方法,从可降解有机溶剂的Pseudomonas fluorescens JCM5963菌株中成功克隆了一个新的脂肪酶基因PFL296,并以有活性的聚集体的形式在E. coli中实现了高水平的表达。通过对重组酶性质表征发现,PFL296编码的酶蛋白PFL的分子量是32 426 kD,最适温度为55℃,最适pH值为8.8,具有较好的低温水解能力和高温活性,具有较宽范围的pH稳定性以及碱性作用条件,因此具有作为洗涤剂用酶的应用潜力。重组PFL的另一个重要性质是在多种水溶性有机溶剂的存在下得到激活并保持稳定,对一些水不溶性的有机溶剂也具有一定的耐受性,这些特点使其具有很好的应用于有机合成的潜力。在此基础上,本文对重组PFL在立体选择性拆分（R, S）-2-[（2-甲基-6-乙基）苯基氨基]丙酸（（R, S）-NEMPA）和（R, S）-2-辛醇中的应用进行了研究。结果表明,重组酶的粗酶聚集体和全细胞酶制剂形式都分别表现出了较好的实际应用价值。

论文目录

• 内容提要
• 第一章 前言
• 1.1 脂肪酶的研究进展
• 1.1.1 脂肪酶简介
• 1.1.2 脂肪酶的结构特征
• 1.1.3 脂肪酶的催化机制
• 1.1.4 脂肪酶的分类
• 1.2 假单胞菌脂肪酶的研究进展
• 1.2.1 假单胞菌简介
• 1.2.2 假单胞菌脂肪酶的分泌机制研究
• 1.2.3 假单胞菌脂肪酶基因的克隆及表达
• 1.2.4 假单胞菌脂肪酶的生化性质
• 1.2.5 有机溶剂稳定性
• 1.3 脂肪酶聚集行为分析
• 1.3.1 脂肪酶聚集的普遍性
• 1.3.2 脂肪酶聚集的原因
• 1.3.3 脂肪酶聚集体性质的变化
• 1.4 全细胞生物催化剂的制备和应用
• 1.4.1 全细胞生物催化剂的特点
• 1.4.2 提高细胞膜通透性
• 1.4.3 全细胞生物催化剂的应用
• 1.5 脂肪酶催化手性拆分
• 1.5.1 手性普遍性和重要性
• 1.5.2 手性化合物的拆分策略
• 1.5.3 脂肪酶催化的动力学拆分基础
• 1.5.4 提高脂肪酶催化立体选择性的方法
• 1.6 本课题的科学意义、设计思路和创新点
• 1.7 参考文献
• 第二章 假单胞荧光菌脂肪酶基因的克隆
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 数据库中假单胞脂肪酶的分类
• 2.3.2 脂肪酶简并引物的设计
• 2.3.3 Pseudomonas. fluorescens JCM 5963 的培养
• 2.3.4 Pseudomonas. fluorescens JCM 5963 基因组的提取
• 2.3.5 脂肪酶基因的PCR扩增
• 2.3.6 重组质粒的构建
• 2.3.7 重组质粒的转化和及鉴定
• 2.3.8 重组质粒的序列测定
• 2.4 小结
• 2.5 参考文献
• 第三章 蛋白质序列分析和结构预测
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 生物信息学工具和网络资源
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 序列同源性分析
• 3.2.2.2 同源模建
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 蛋白序列的motif搜索
• 3.3.2 蛋白序列的一级结构分析
• 3.3.3 蛋白序列的二级结构预测
• 3.3.4 序列同源性分析及进化关系
• 3.3.5 同源模建
• 3.4 小结
• 3.5 参考文献
• 第四章 重组 PFL 的优化表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 表达工程菌的筛选和鉴定
• 4.3.2 表达载体及宿主菌株的优化
• 4.3.3 IPTG诱导条件的优化
• 4.3.4 工程菌诱导表达曲线的绘制
• 4.3.5 培养基的优化
• 4.4 小结
• 4.5 参考文献
• 第五章 PFL的分离纯化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 目的蛋白的表达与纯化
• 5.3.1.1 酶在粗提液中的聚集现象
• 5.3.1.2 粗酶液的制备
• 5.3.1.3 Ni-NTA亲和层析纯化
• 5.3.2 非变性电泳和活力染色
• 5.3.3 凝胶过滤层析测蛋白分子量
• 5.4 小结
• 5.5 参考文献
• 第六章 重组PFL的基本酶学性质
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 实验方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 温度对酶活的影响
• 6.3.2 pH对酶活的影响
• 6.3.3 底物对酶的影响
• 6.3.4 动力学常数测定
• 6.3.5 金属离子对酶的影响
• 6.3.6 胆酸钠盐对酶活的影响
• 6.3.7 有机溶剂对酶的影响
• 6.4 小结
• 6.5 参考文献
• 第七章 重组PFL催化拆分（R, S）-2-[（2-甲基-6-乙基）苯基氨基]丙酸的研究
• 7.1 引言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 实验材料
• 7.2.2 实验方法
• 7.2.2.1 重组PFL全细胞酶制剂的制备
• 7.2.2.2 重组PFL粗酶聚集体制剂和纯酶制剂的制备
• 7.2.2.3 酶催化（R, S）-NEMPA-ME的酯水解反应
• 7.2.2.4 毛细管柱的准备
• 7.2.2.5 NEMPA 转化率（C）的检测
• 7.2.2.6 NEMPA对映体过量值（eep）的检测
• 7.2.2.7 立体选择性比率（E）的计算
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 不同酶制剂形式的比较
• 7.3.2 酶加入量对催化拆分反应的影响
• 7.3.3 温度对催化拆分反应的影响
• 7.3.4 pH对催化拆分反应的影响
• 7.3.5 有机溶剂对酶活性和立体选择性的影响
• 7.3.6 CEA-rPFL的重复使用
• 7.4 小结
• 7.5 参考文献
• 第八章 重组PFL催化拆分手性2-辛醇的研究
• 8.1 引言
• 8.2 材料和方法
• 8.2.1 实验材料
• 8.2.2 实验方法
• 8.2.2.1 酶催化（R, S）-2-辛醇的酯交换反应
• 8.2.2.2 底物转化率的测定
• 8.2.2 3 2-辛醇的光学纯度（ees）的测定
• 8.2.2.4 立体选择性比率（E）的测定
• 8.3 结果与讨论
• 8.3.1 酶的活性比较和加入量的确定
• 8.3.2 重组PFL酶制剂的催化活性和立体选择性比较
• 8.3.3 WC-rPFL催化拆分应反应条件的优化
• 8.3.3.1 底物摩尔比
• 8.3.3.2 温度的影响
• 8.3.3.3 水活度的影响
• 8.3.3.4 有机溶剂的影响
• 8.3.4 WC-rPFL催化拆分（R, S）2-辛醇反应进程
• 8.3.5 WC-rPFL的重复使用
• 8.4 小结
• 8.5 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文及其它成果
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT