论文摘要
前言肿瘤是典型的血管依赖性病变，肿瘤的恶性生长和转移依赖于肿瘤血管新生。肿瘤血管新生是在多种因素的严密调控下进行的，是促进血管新生因素和抑制血管新生因素间失衡的结果。新生的肿瘤血管增加肿瘤的血液灌注，促进肿瘤生长、浸润和转移。目前以肿瘤血管新生为靶点的治疗已成为肿瘤治疗研究领域的主要方向之一。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，与多种肿瘤的发生、发展密切相关。血管生成素-2（angiopoietin-2，-Ang-2）可特异性作用于血管内皮细胞，在血管生成及维持血管平衡中起重要作用。研究发现COX-2抑制剂可抑制肿瘤生长，增加肿瘤组织坏死。但其对肿瘤细胞中血管生成素-2表达的影响国内尚无报道。本实验在体外培养人脐带静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）和人神经胶质瘤细胞，应用Matrigel建立血管形成的体外培养体系，来研究塞来昔布对肿瘤细胞诱导血管形成及肿瘤细胞中血管生成素表达的影响，进而探讨塞来昔布与肿瘤血管新生的关系及其作用机制。方法采用改进的Jaffe氏培养法进行HUVECs培养，应用Matrigel诱导内皮细胞形成管腔结构，建立血管形成的体外培养体系，然后施加实验因素。体外分离培养人神经胶质瘤细胞，待细胞达到亚融合状态后，制备肿瘤细胞条件培养液。以二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）为溶剂将塞来昔布制成20μm／l、40μm／l、60μm／l三种浓度试剂。实验分两部分，第一部分观察HUVECs在Matrigel上形成管腔结构的情况。分三组，第一组实验分为对照组（无血清DMEM培养液）和不同浓度的肿瘤细胞条件培养液作用组（肿瘤细胞上清液与DMEM培养液比分别为1：2、1：1、2：1），作用24小时。第二组为塞来昔布浓度效应组（20μm／l、40μm／l、60μm／l）对照组加入二甲基亚砜。第三组为塞来昔布时间效应组（12h、24h、48h）对照组加入二甲基亚砜。第二部分检测Ang-2蛋白的表达，同样分塞来昔布浓度效应组和塞来昔布时间效应组。各试验组用倒置相差显微镜观察、照相，然后用95％冰乙醇固定，进行GFAP和Ang-2免疫细胞化学染色。采用光学显微镜下计数管腔数及计算机图像分析对结果进行测定。最后用统计学方法进行分析。结果肿瘤细胞条件培养液作用于培养的HUVECs后，培养体系的管腔数增多。塞来昔布作用后培养体系的管腔数减少，且在一定范围内呈剂量和时间依赖效应（P＜0.01）；随培养体系的管腔数减少，神经胶质瘤细胞Ang-2表达减少，且在一定范围内呈剂量和时间依赖效应（P＜0.01）。讨论环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）由细胞因子、生长因子和肿瘤促进因子诱导产生，在炎症和肿瘤组织中过表达。COX-2存在增殖性细胞、内皮细胞和间质细胞中，能促进肿瘤血管新生和肿瘤生长，因此选择性COX-2抑制剂对恶性实体瘤的治疗是一种有前景的治疗方法。但COX-2抑制剂对人神经胶质瘤的作用以前未见报道。本实验主要目的是明确选择性COX-2抑制剂对人神经胶质瘤诱导的血管新生及Ang-2表达的影响。肿瘤的血管新生是受血管新生因子和血管新生抑制因子的调节。在体内，肿瘤的血管新生因子主要来源于肿瘤细胞，由肿瘤细胞释放，作用于血管内皮细胞，促其增生形成新生血管。本实验观察到肿瘤条件培养液作用于培养的HUVECs后培养体系的管腔数增多，且在一定范围内呈剂量依赖效应。推测肿瘤细胞可通过分泌某些促血管新生因子促进肿瘤血管新生。我们在培养体系中加入不同浓度的塞来昔布溶液及用其作用不同时间，治疗组与对照组相比管腔数明显减少且在一定范围内呈剂量及时间依赖效应。Ang-2是血管生成素（angiogenin）家族中的一员。肿瘤细胞在缺氧条件下分泌较多的VEGF和Ang-2，并使Ang-2在VEGF的协同作用下，促进肿瘤坏死组织周围新生血管的形成。在本实验中我们观察到治疗组与对照组相比Ang-2的表达明显减少且在一定范围内呈剂量及时间依赖效应。提示塞来昔布作为一种选择性COX-2抑制剂可通过COX-2依赖途径在蛋白水平上抑制神经胶质瘤细胞分泌Ang-2，从而抑制肿瘤血管新生。结论1、肿瘤细胞可以促进Matrigel体外诱导人血管内皮细胞的血管形成，并在一定范围内呈剂量依赖效应。2、塞来昔布可以抑制人神经胶质细胞促血管新生作用，并在一定范围内呈剂量及时间依赖效应。3、塞来昔布可以下调人神经胶质细胞中Ang-2表达，并在一定范围内呈剂量及时间依赖效应。
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