新型免疫分子Tim-4对小鼠巨噬细胞系RAW264.7生物学活性的影响

论文摘要

目的:T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白（T cell immunoglobulin domain andmuein domain protein,Tim）家族是与疾病相关的一个新基因家族。Tim-4是Tim家族成员之一,小鼠Tim-4仅选择性表达于抗原提呈细胞----巨噬细胞和树突状细胞表面。本研究的主要目的是探讨Tim-4对小鼠巨噬细胞生物学活性的影响,为调节巨噬细胞功能活性的研究提供新的思路,为新型免疫分子Tim-4的相关研究提供新的理论学说,为干预巨噬细胞参与的相关疾病提供新的靶点。方法:1.Tim-4在小鼠巨噬细胞中的表达及阻断Tim-4对小鼠巨噬细胞系RAW264.7生物学活性的影响将小鼠巨噬细胞系RAW264.7接种于24孔培养板,24 h后加入LPS刺激,终浓度分别为10 ng/mL、50 ng/mL及100 ng/mL,同时设PBS对照组。48h后收集细胞,RT-PCR检测Tim-4 mRNA表达,流式细胞术检测Tim-4蛋白表达。将小鼠巨噬细胞系RAW264.7接种96孔培养板,24 h后其中两组分别加入羊IgG（终浓度为5μg/mL）、羊抗小鼠Tim-4抗体（终浓度为5μg/mL）,37℃孵育1 h,再分别加入LPS（终浓度为1 00 ng/mL）。另外两组分别加入PBS和LPS（终浓度为100 ng/mL）,48 h后收集细胞培养上清,Griess法检测NO的分泌,RT-PCR检测诱生型一氧化氮合酶（indueible Nitric OXide Synthase,iNOS）mRNA的表达。2.稳定高表达Tim-4巨噬细胞系的建立及鉴定设计Tim-4特异性引物,包含HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,以小鼠腹腔巨噬细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增小鼠Tim-4全基因片段,凝胶电泳,观察分析结果。PCR产物经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,回收克隆入pcDNA3.0载体,进行连接、转化,LA平板筛选阳性克隆pcDNA3.0-Tim-4。PCR、酶切及DNA测序分析鉴定其正确性。利用脂质体转染试剂盒将重组子转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,经G418筛选,建立稳定高表达Tim-4的小鼠巨噬细胞系RAW264.7-T4,经RT-PCR、流式细胞术和免疫细胞化学染色的方法检测Tim-4 mRNA和蛋白的表达水平。3.Tim-4基因过表达对小鼠巨噬细胞系RAW264.7生物学活性的影响利用建立的稳定高表达小鼠Tim-4的巨噬细胞系RAW264.7-T4,以稳定转染pcDNA3.0的细胞系RAW264.7-P为对照组,接种于96孔培养板,各组设LPS刺激组（终浓度为100 ng/mL）与PBS对照组,LPS刺激24 h后收集培养上清,Griess法检测NO的分泌,抽提各组细胞总RNA,RT-PCR分析各组细胞iNOS及TNF-αmRNA的表达。收集RAW264.7-P、RAW264.7-T4两组细胞,流式细胞术检测细胞表面分子MHC-Ⅱ类分子、CD80、CD86的表达及对FITC-右旋糖酐（FITC-dextran）的吞噬能力。结果1.Tim-4在小鼠巨噬细胞中的表达及阻断Tim-4对小鼠巨噬细胞系RAW264.7生物学活性的影响利用RT-PCR的方法检测Tim-4 mRNA的表达,结果显示巨噬细胞RAW264.7仅表达较低水平的Tim-4,而100 ng/mL LPS刺激后Tim-4的表达明显升高。流式细胞术检测发现经LPS刺激后,Tim-4蛋白的表达呈现上升趋势,并呈剂量依赖性。分别收集PBS对照组、LPS刺激组、羊IgG加LPS刺激组及Tim-4抗体加LPS刺激组的细胞培养上清,检测NO的分泌,结果显示Tim-4抗体加LPS刺激组NO的分泌显著高于IgG对照组（50.4±4.49μmol/L;35.44±5.12μmol/L,P＜0.05）,抽提各组细胞总RNA,RT-PCR检测结果显示,Tim-4抗体加LPS刺激组iNOSmRNA表达水平亦显著高于对照组（1.56±0.05;1.17±0.07,P＜0.05）。2.稳定高表达Tim-4巨噬细胞系的建立及鉴定将成功构建的pcDNA3.0-Tim-4真核表达载体及对照载体pcDNA3.0分别转染入RAW264.7细胞,经G418筛选,RT-PCR和流式细胞术、免疫细胞化学染色分析发现RAW264.7-T4细胞其Tim-4在mRNA和蛋白质水平上都有较高表达,表明成功建立了稳定高表达小鼠Tim-4的巨噬细胞系（将建立的细胞系分别命名为RAW264.7-74 RAW264.7-P）。3.Tim-4过表达对小鼠巨噬细胞系RAW264.7生物学活性的影响利用建立的稳定高表达小鼠Tim-4的巨噬细胞模型,以pcDNA3.0转染RAW264.7并筛选成功的细胞（RAW264.7-P）为对照组,发现RAW264.7-T4细胞LPS（终浓度100 ng/mL）刺激与未刺激时其NO分泌及iNOS、TNF-αmRNA表达均显著低于RAW264.7-P组（P＜0.05）。高表达小鼠Tim-4的巨噬细胞组其表面分子CD80的表达百分率低于空载体组（26.12±0.84:80.5±1.96）,CD86分子的表达百分率亦低于空载体组（3.63±1.75:1.4±1.05）,差异有统计学意义（P＜0.05）;而两组细胞MHC-Ⅱ类分子的表达及对FITC-dextran的吞噬能力均无显著性差异（P＞0.05）。结论:小鼠巨噬细胞RAW264.7表达内源性Tim-4,经丝裂原LPS刺激后,Tim-4mRNA及蛋白水平上调,并呈剂量依赖性:Tim-4通过影响NO分泌、iNOS、TNF-αmRNA的表达及共刺激分子CD80、CD86的表达负性调节小鼠巨噬细胞RAW264.7的生物学活性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 Tim-4在小鼠巨噬细胞中的表达及阻断Tim-4对小鼠巨噬细胞RAW264.7生物学活性的影响
• 1 材料
• 1.1 细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试剂盒
• 1.4 DNA分子量
• 1.5 PCR引物设计与合成
• 1.6 其他试剂
• 1.7 主要实验仪器
• 2 方法
• 2.1 Tim-4在小鼠巨噬细胞中的表达
• 2.1.1 RT-PCR检测小鼠巨噬细胞系RAW264.7 Tim-4 mRNA的表达
• 2.1.2 流式细胞术检测小鼠巨噬细胞系RAW264.7 Tim-4蛋白的表达
• 2.2 阻断Tim-4对小鼠巨噬细胞系RAW264.7生物学活性的影响
• 2.2.1 Griess反应检测细胞培养上清中NO水平
• 2.2.2 RT-PCR检测iNOS mRNA的表达
• 2.3 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 Tim-4在小鼠巨噬细胞中的表达
• 3.2 阻断Tim-4对小鼠巨噬细胞系RAW264.7生物学活性的影响
• 第二部分 稳定高表达Tim-4小鼠巨噬细胞系的建立及鉴定
• 1 材料
• 1.1 实验动物及来源
• 1.2 质粒与菌种
• 1.3 细胞
• 1.4 主要试剂
• 1.5 PCR引物
• 1.6 DNA分子量Marker
• 1.7 PCR引物设计与合成
• 1.8 其他试剂
• 2 方法
• 2.1 pcDNA3.0-Tim-4重组体的构建
• 2.1.1 Tim-4全基因片段的扩增
• 2.1.2 Tim-4全基因片段的回收
• 2.1.3 目的基因Tim-4与载体pcDNA3.0连接
• 2.1.4 连接产物的转化
• 2.1.5 阳性重组子的筛选与鉴定
• 2.2 稳定高表达Tim-4小鼠巨噬细胞系的建立
• 2.2.1 抽取与纯化质粒DNA
• 2.2.2 RAW264.7细胞培养
• 2.2.3 脂质体转染
• 2.3 稳定高表达Tim-4小鼠巨噬细胞系的鉴定
• 2.3.1 RT-PCR检测Tim-4 mRNA的表达
• 2.3.2 流式细胞术检测Tim-4蛋白的表达
• 2.3.3 免疫细胞化学染色检测Tim-4蛋白的表达
• 3 结果
• 3.1 pcDNA3.0-Tim-4重组体的鉴定
• 3.2 RT-PCR检测Tim-4 mRNA的表达
• 3.3 流式细胞术检测Tim-4蛋白的表达
• 3.4 免疫细胞化学染色检测Tim-4蛋白的表达
• 第三部分 Tim-4过表达对小鼠巨噬细胞系RAW264.7生物学活性的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 Griess反应检测细胞培养上清中NO水平
• 2.2 RT-PCR检测iNOS及TNF-α mRNA的表达
• 2.3 流式细胞术检测MHC-Ⅱ类分子及CD80、CD86的表达
• 2.4 流式细胞术检测对FITC-Dextran的吞噬能力
• 2.5 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 Tim-4过表达对小鼠巨噬细胞系RAW264.7分泌NO的影响
• 3.2 Tim-4过表达对小鼠巨噬细胞系RAW264.7 iNOS及TNF-α mRNA表达的影响
• 3.3 Tim-4过表达对小鼠巨噬细胞系RAW264.7 MHC-Ⅱ类分子及CD80、CD86表达的影响
• 3.4 Tim-4过表达对小鼠巨噬细胞系RAW264.7吞噬FITC-Dextran能力的影响
• 讨论
• 附图
• 附录
• 质粒物理图谱
• NO检测标准曲线
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章
• 学位论文评阅及答辩情况表