论文摘要
细粒棘球蚴病（CE）又称囊性包虫病是由细粒棘球绦虫的续绦期幼虫寄生于人和动物体内引起的一类重要的、具有地方流行性的人畜共患寄生虫病。CE呈全球性分布，畜牧业发达的地方往往是此病的流行区。我国CE主要分布于西部和北部的内蒙古、新疆、甘肃、宁夏、青海、四川和西藏等地。疫苗是防治包虫病的一种重要途径，该研究领域涉及天然蛋白疫苗、重组蛋白疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗和重组伤寒沙门氏杆菌疫苗等。Eg95抗原基因在细粒棘球绦虫六钩蚴期表达，具有株系间的高度保守性，是一种可以诱导机体免疫保护的有效的疫苗候选分子。利用PCR技术从细粒棘球蚴中扩增出Eg95基因DNA，构建了pMD19-T／Eg95 DNA重组克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经抗生素筛选获得重组子，进行DNA测序，利用GenBank／BLAST功能对Eg95-NM DNA序列与GenBank中已有的Eg95基因家族的成员进行序列比较分析，结果表明编码区完全一致。利用RT-PCR技术从细粒棘球蚴中扩增了Eg95基因cDNA，构建了重组克隆载体pMD19-T／Eg95 cDNA，转化E.coli DH5α感受态细胞，经抗生素筛选获得重组子并测序，结果发现Eg95-NM基因cDNA序列与基因DNA序列编码区出现5个碱基差异，编码的氨基酸有4个发生改变。因此，以DNA序列编码区推导的理论氨基酸为基础，对Eg95蛋白的相关特性及抗原表位加以分析，结果表明变异的58和122位氨基酸处于抗原表位形成区，所以选定编码这两个氨基酸的变异碱基进行PCR定点突变，以确保Eg95蛋白的正确表达。PCR定点突变后测序结果表明，预期位点碱基已被修正。得到的Eg95-NM基因cDNA序列长度为471bp，表达16.9 Kda的Eg95抗原。将定点突变后修正后的Eg95基因cDNA序列克隆至原核表达载体pET44a（+）上，构建了重组原核表达载体pET44a（+）／Eg95。载体pET44a（+）上大小约66.4KDa的标签NusA蛋白与Eg95-NM融合，预期表达83.3 KDa的融合蛋白。经测序鉴定后转化E.coli BL21（DE3）菌株在IPTG诱导下，重组菌株表达了融合蛋白质。经SDS-PAGE检测结果显示，重组质粒表达了约83.3 KDa的目的条带。Western-blotting试验证明，该融合蛋白表达产物可与囊性包虫病人血清特异结合，说明该融合蛋白得到了正确的表达。