体细胞克隆猪胚胎制备及鉴定的研究

论文摘要

体细胞克隆猪在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大的优势和应用潜力,已成为当今体细胞克隆领域研究的热点。本研究的目的在于研究猪体细胞核移植的技术条件,简化核移植方法及程序,提高核移植效率,建立高效的体细胞核移植技术研究平台,为高效快速生产克隆动物,制作转基因克隆动物打下基础。本实验通过对猪的卵母细胞的成熟、供体细胞的制备、体细胞克隆胚胎的构建、胚胎移植和对出生克隆猪的鉴定等几个方面的研究,优化了实验条件,建立了比较完善的系统,成功的生产了上海首例克隆猪。研究结果如下:1.比较不同基础培养液对卵丘-卵泡复合体（COCs）体外成熟的影响,结果显示,在NCSU-23和mTCM-199培养液中,COCs的成熟率较高,分别达到86.89%和89.94%,与TCM199比较（成熟率75.37%）差异显著,而前二者差异不显著,说明NCSU-23和mTCM-199培养液是较为理想的成熟培养液,两种培养液均可应用于COCs培养成熟,可获得较好的成熟率。2.比较了纺锤体观测（spindle-view）系统去核方法和盲吸法对猪卵母细胞的去核率,结果显示,纺锤体观测（spindle-view）系统去核法,去核率为97.89%,盲吸法去核率为60.32%。两者之间差异极显著（p< 0.01）。说明spindle-view系统去核法是一种安全、高效的去核方法。3.供体细胞选择了巴马香猪的胎儿成纤维细胞、耳成纤维细胞和颗粒细胞,其中颗粒细胞的融合率较低（64.23%）,与猪胎儿成纤维细胞（74.55%）和耳成纤维细胞（77.55%）的融合率比较差异显著,而在卵裂率和囊胚率上差异不显著。通过本实验证明猪的胎儿成纤维细胞可以用于克隆猪的制作。4.通过对克隆胚胎的体外培养,在B2和NCSU-23中卵裂胚数（73.55%vs79.19%）和囊胚数（19.83%vs21.48%）,差异都不显著。结果表明B2和NCSU-23都是比较适合猪克隆胚发育的体外培养液。4.通过多次的克隆胚胎移植手术,本实验建立了比较完善的猪胚胎移植体系,移植后成功出生克隆猪一只。通过外型特征观察、微卫星检测证明这只巴马小香猪和供体胚胎干细胞的遗传物质一致。选择经产母猪作为代孕母猪,在输卵管深部移植200枚左右克隆胚胎加孤雌胚胎,通过比较春秋冬季移植效果,冬季未有出生小猪,春末出生克隆猪一头,结果表明移植季节最好选择春夏季。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1. 克隆猪研究现状
• 2. 猪体细胞核移植的关键技术
• 3. 重构胚胎的培养移植以及受孕的诱导和维持
• 4. 胚胎移植
• 5. 核移植的应用价值
• 6. 核移植存在的问题
• 7. 本实验研究的目的和意义
• 试验部分
• 实验一 猪卵母细胞的体外成熟
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验设计
• 4. 数据分析
• 5. 结果
• 6. 讨论
• 实验二 供体细胞的准备
• 1 实验材料
• 2.供体细胞制作方法
• 3. 结果
• 4.讨论
• 实验三 体细胞克隆胚胎的构建
• 1.材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4 讨论
• 实验四 克隆胚胎的移植与克隆猪的鉴定
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 4. 讨论
• 结论
• 附录-主要试剂的配制
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文