论文摘要
目的tumstatin是由Ⅳ型胶原α3链的中间3股螺旋区域C-端12个氨基酸和非胶原区1（NC1）232个氨基酸,共244个氨基酸组成。对体外、体内新生血管形成和肿瘤移植瘤模型的研究表明重组tumstatin显著抑制血管内皮细胞增殖、特异性诱导内皮细胞凋亡,进而抑制肿瘤生长。人肿瘤坏死因子（TNF-a）是一种在免疫调节和抗肿瘤防御机制中起重要作用的细胞因子。本次研究是利用RT-PCR技术从人胚肾293细胞中扩增出tumstatin全长基因,将tumstatin和TNF-α通过GGGSGGSG柔性连接短肽相连,构建一个tumstatin和人TNF-α融合蛋白,希望产生一种分泌型双功能蛋白tumstatin-TNF,即同时特异地杀伤肿瘤组织血管内皮细胞和肿瘤细胞,从而改善其抗肿瘤的活性。方法以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin。利用PCR从pGEM-T/tumstatin中扩增携带Ⅳ型胶原信号肽sig基因的sig-tumstatin基因片段。以sig-tumstatin和PBV220-TNF-a载体为模板,分别扩增出携带连接片段（linker）的sig-tumstatin-linker基因片段和linker-TNF基因片段,再以所述两基因片段为模板,用重叠区扩增拼接法（SOEing）扩增得到sig-tumstatin-linker-TNF融合基因,融合基因sig-tumstatin-linker-TNF经NheⅠ/BamHⅠ酶切后,插入经同样酶切pIRESneo3质粒,筛选阳性克隆获得重组质粒,并经限制性内切酶和基因测序验证。将重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF质粒用脂质体法转染到CHO-K1,用G418（700 mg/L）进行筛选2周,从而获得稳定的转染细胞,并对其表达状况进行检测。通过对内皮细胞增殖抑制试验、内皮细胞管状结构形成试验、内皮细胞凋亡试验和L929细胞的细胞毒试验证实tumstatin-TNFα融合蛋白是否保持tumstatin样活性和TNF样活性。结果测序结果表明所获得的sig-tumstatin-linker-TNF融合基因（1.32 kb）序列与设计的完全一致。双酶切鉴定结果表明重组表达载体pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF构建成功。Western blot结果证实转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF的CHO-K1分泌表达了tumstatin-TNF融合蛋白,分子量约为45 kD。内皮细胞增殖抑制试验结果表明tumstatin-TNF融合蛋白显著抑制内皮细胞增殖并呈剂量依赖性,ED50约为2μg/ml,tumstatin也抑制ECV304细胞增殖,ED50约7.6μg/ml。内皮细胞管状结构形成实验表明tumstatin-TNF融合蛋白显著抑制内皮细胞管状结构形成,2μg/ml tumstatin-TNF融合蛋白组管状结构形成百分率为4.1±1.4%。内皮细胞凋亡试验结果表明tumstatin-TNF（100 ng/ml）诱导内皮细胞早期凋亡的能力比tumstatin（5μg/ml）强50倍。对L929细胞的杀伤活性方面tumstatin-TNF融合蛋白和TNF相比区别不大。另外,从生长曲线结果来看,转染pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体和空载体的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢。总之,tumstatin-TNF融合蛋白保持了tumstatin样活性和TNF样活性。结论通过基因重组技术将两个通过不同机理发挥有效抗癌作用的蛋白结合起来产生一个具有双功能的分泌型融合蛋白tumstatin-TNF。①成功构建了分泌型融合蛋白tumstatin-TNF的真核表达载体pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF。②重组表达载体pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF在真核细胞CHO-K1中实现了分泌型表达。③Tumstatin-TNF融合蛋白显著抑制内皮细胞增殖并呈剂量依赖性,tumstatin-TNF融合蛋白抑制内皮细胞增殖活性比tumstatin高。④tumstatin-TNF融合蛋白对L929细胞的杀伤活性方面和TNF相比区别不大。⑤tumstatin-TNF（100 ng/ml）诱导内皮细胞早期凋亡的能力比tumstatin（5μg/ml）强。⑥tumstatin对内皮细胞管状结构形成的抑制能力不如tumstatin-TNF。我们成功地构建了重组人tumstatin-TNF融合蛋白真核表达载体并获得能稳定表达tumstatin-TNF融合蛋白的CHO-K1细胞株,为进一步开展实验奠定了基础。
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标签：肿瘤抑素论文; 肿瘤坏死因子论文; 重组融合蛋白论文; 中国仓鼠卵巢细胞论文; 表达载体论文;