中华按蚊肠道细菌分子多态性研究

论文摘要

中华按蚊(Anopheles sinensis)是我国传播疟疾的主要媒介,在我国分布广,种群数量大。通过研究中华按蚊肠道细菌多样性,可以为探讨其肠道细菌对中华按蚊的生理功能和生态学意义奠定基础,为进一步了解中华按蚊与其共生菌的协同进化、物种进化途径提供新的认知,最终为防治中华按蚊和控制疟疾提供新思路。本研究通过利用16S rRNA基因序列分析和PCR—DGGE分析技术研究了中华按蚊幼虫、成虫和不同地理种群成虫肠道细菌多样性。在中华按蚊幼虫肠道中分离出28种细菌,系统发育地位上分属5大菌纲:丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、乙型变形菌纲(Betaproteobacteria)和厚壁菌纲(Firmicutes),其中丙型变形菌纲和放线菌纲的细菌在肠道细菌中约占80%。对于中肠,丙型变性菌纲的细菌所占比例为57.6%,为中肠的主要细菌群落;放线菌纲在后肠的比例为37.6%,是后肠的主要细菌群落。而对于整个肠道,放线菌纲Leucobacter属和黄杆菌纲金黄杆菌属细菌占整个肠道细菌19%和10.6%,为中华按蚊幼虫肠道优势菌。采用16S rRNA克隆文库技术对中华按蚊成虫肠道细菌多样性进行研究时共检测到12条16S rRNA基因序列。在系统发育地位上主要归X3个细菌纲:丙型变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌纲,其中有59.8%的细菌属于丙型变形菌纲。丙型变性菌纲在中肠和后肠分别占54%和65.6%,占绝对优势,成为中后肠主要细菌群落。与Enterobacter sp.(EF599680)高度同源(同源性99%)的细菌和杆菌纲金黄杆菌属的Chryseobacterium meningosepticum在成虫肠道中分布比例分别为16.4%和13.8%,成为中华按蚊成虫肠道优势菌。在研究中华按蚊5个不同地理种群成虫肠道细菌多样性时发现:中华按蚊不同地理种群肠道中都存在肠杆菌属和金黄杆菌属的细菌,这些细菌的存在与地理位置和生态环境无对应关系。通过聚类分析得知,中华按蚊不同地理种群肠道细菌可分为2大类:第一类包括实验种、湖北武汉种、湖南娄底种和四川邛崃种,第二类包括浙江衢州种和湖北黄梅种,同一类的中华按蚊肠道细菌种类相似系数大,存在一定的相似性。这些地区的地理分布、气候等外界环境对肠道菌群的结构有一定影响,取食不同食物在内的各种因素也会对肠道微生物的菌群结构及含量产生影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 昆虫体内共生微生物的研究进展
• 1.1 昆虫体内共生菌的分布
• 1.1.1 肠道共生菌
• 1.1.2 脂肪体共生菌
• 1.1.3 其他部位共生菌
• 1.1.4 细胞外共生物和细胞内共生物
• 1.2 共生菌对昆虫的生理功能和意义
• 1.2.1 为昆虫合成重要的营养成分
• 1.2.2 参与氮素循环
• 1.2.3 解毒作用
• 1.2.4 协助昆虫消化特种食物
• 1.2.5 参与昆虫生殖活动的调控
• 1.3 昆虫共生菌的研究意义
• 2 按蚊及其肠道微生物的研究进展
• 3 细菌16S rRNA基因及其在肠道微生物研究中的应用
• 3.1 细菌16S rRNA基因简介
• 3.2 16S rRNA在肠道微生物研究中的应用
• 4 DGGE技术在肠道微生物研究中的应用
• 4.1 DGGE原理
• 4.2 PCR-DGGE在肠道微生物研究中的应用
• 5 本项研究的意义及创新点
• 5.1 本项研究的意义
• 5.2 本项目的特色与创新之处
• 第二章 中华按蚊幼虫肠道细菌分子多态性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 中华按蚊的饲养
• 1.1.2 常用试剂、培养基及抗生素的配制
• 1.1.3 试验仪器
• 1.1.4 引物序列
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 中华按蚊幼虫解剖
• 1.2.2 肠道微生物总DNA提取
• 1.2.3 细菌16S rDNA片段的扩增
• 1.2.4 细菌16S rDNA片段克隆
• 1.2.5 PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳分析
• 1.2.6 DGGE分离后的PCR产物的电泳条带的指纹图谱分析
• 1.2.7 测序
• 1.2.8 数据统计分析与系统发育树构建
• 1.2.9 序列登录号
• 2 结果与分析
• 2.1 中华按蚊幼虫解剖
• 2.2 两种方法提取总DNA的结果比较
• 2.3 基因组DNA的PCR扩增
• 2.4 基因组DNA的克隆
• 2.5 PCR产物的变性梯度凝胶电泳分析
• 2.6 序列分析
• 3 讨论
• 第三章 中华按蚊成虫肠道细菌分子多态性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 中华按蚊成虫解剖
• 1.2.2 肠道微生物总DNA提取
• 1.2.3 细菌16SrDNA片段的扩增
• 1.2.4 细菌16SrDNA片段克隆
• 1.2.5 PCR产物的DGGE分析
• 1.2.6 测序
• 1.2.7 数据统计分析与系统发育树构建
• 1.2.8 序列登录号
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增结果
• 2.2 细菌16SrDNA的克隆
• 2.3 DGGE结果
• 2.4 序列分析
• 3 讨论
• 第四章 中华按蚊成虫不同地理种群肠道细菌多样性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 中华按蚊样本采集
• 1.1.2 实验试剂、仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 蚊肠道微生物的获取
• 1.2.2 蚊肠道微生物总DNA的制备
• 1.2.3 PCR扩增
• 1.2.4 PCR产物的DGGE分析
• 1.2.5 结果统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 蚊肠道微生物PCR扩增结果
• 2.2 肠道细菌PCR产物的DGGE分析
• 3 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者在攻读硕士学位期间发表论著