转RCH10和AGLU1基因水稻后代的分子细胞学检测及抗纹枯病的相关研究

论文摘要

由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani K（u丨¨）hn）引起的水稻纹枯病是我国水稻的“三大”病害之一。目前水稻种质库中尚未发现有对纹枯病的高水平抗源,基因工程育种为选育具有广谱抗性并且可以稳定遗传的抗病品种提供了可能而显得非常重要。浙江大学首次将水稻几丁质酶基因RCH10和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因AGLU1双价基因表达盒Z100转化水稻,获得了转基因水稻并筛选出抗纹枯病株系YH-19和YH-24。本研究对筛选出的抗纹枯病转基因水稻株系YH-19和YH-24的第六代（T6）进行了表达盒中基因的遗传稳定性及抗病性分析。PCR检测发现所有被检测的T6代转基因植株保留NPTII基因,而15%的植株发生RCH10基因或AGLU1基因的丢失,其中1株被检植株甚至丢失了RCH10和AGLU1双基因。对保留RCH10和AGLU1双基因的T6转基因植株进行Northern杂交和GUS组织化学染色的结果表明RCH10和AGLU1双基因在这些T6转基因植株中表达。这些保留RCH10和AGLU1双基因的T6转基因植株在接种纹枯菌后表现出的抗性显著强于野生型水稻。相应地,这些保留RCH10和AGLU1双基因的T6转基因植株中的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性显著高于野生型植株中的。免疫金标记几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶也显示二者在转基因植物叶细胞中的含量显著高于在野生型植物叶细胞中的,而且RCH10和AGLU1在转基因植物叶细胞的叶绿体中积累。本研究进一步建立了用台盼蓝或卡拉唑黑E染色,结合光学显微镜和荧光显微镜的观察,用荧光差异显示区分水稻叶鞘表面和内部的纹枯菌菌丝体的方法。转RCH10和AGLU1双基因水稻株系YH-19和YH-24的T6代植株对纹枯病抗性的确定和荧光差异显示水稻叶鞘内外纹枯菌菌丝体方法的建立,为水稻与纹枯菌互作的研究提供了新的材料和方法,为进一步研究转基因植株抗纹枯病的机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 水稻抗病反应及水稻抗病基因工程
• 1 植物的抗病反应
• 1.1 植物的抗病机制
• 1.2 植物的系统获得抗性及其产生防卫反应过程
• 1.3 抗性相关基因及病原无毒基因的克隆与研究
• 1.3.1 抗病基因（R）
• 1.3.2 无毒基因（Avr）
• 1.3.3 防卫基因
• 2 水稻抗病研究进展
• 2.1 水稻抗病基因的克隆和研究
• 2.2 水稻防卫反应和PR蛋白
• 2.2.1 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的生化特性
• 2.2.2 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶在植物体内的诱导表达
• 2.2.3 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶与植物的防御功能
• 2.3 水稻抗病基因工程
• 3 水稻纹枯病及抗纹枯病转基因的研究
• 3.1 水稻纹枯病病原菌的研究
• 3.1.1 分类地位
• 3.1.2 形态特点
• 3.1.3 寄主范围
• 3.1.4 发病症状及规律
• 3.2 水稻纹枯病菌致病机理
• 3.3 纹枯病转基因抗病研究
• 3.3.1 转化植物自身的几丁质酶和葡聚糖酶等基因
• 3.3.2 转化生防菌中的抗纹枯病基因
• 本研究的意义、目的和主要研究内容
• 6代遗传稳定性及纹枯病抗性分析'>第二章 转基因水稻T₆代遗传稳定性及纹枯病抗性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 水稻
• 1.1.2 纹枯病菌株
• 1.2 方法
• 1.2.1 转基因水稻PCR分析
• 1.2.2 转基因水稻Northern分析
• 1.2.3 转基因水稻的组织化学染色
• 1.2.4 转基因水稻纹枯病抗性鉴定
• 1.3 统计分析
• 2 结果与分析
• 6代转基因水稻植株外源基因的遗传鉴定'>2.1 T₆代转基因水稻植株外源基因的遗传鉴定
• 6代转基因水稻植株外源基因表达的鉴定'>2.2 T₆代转基因水稻植株外源基因表达的鉴定
• 2.3 转基因水稻植株的GUS组织化学染色
• 6代转基因水稻植株的纹枯病抗性'>2.4 T₆代转基因水稻植株的纹枯病抗性
• 3 讨论
• 第三章 RCH10和AGLU1的酶活性测定和亚细胞定位
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 水稻材料
• 1.1.2 胶体金探针
• 1.1.3 RCH10和AGLU1的多克隆抗体
• 1.2 方法
• 1.2.1 粗酶液的提取
• 1.2.2 几丁质酶活性测定
• 1.2.3 β-1,3-葡聚糖酶活性的测定
• 1.2.4 胶体金免疫标记方法
• 2 结果与分析
• 6代转基因水稻中几丁质酶和葡聚糖酶的活力'>2.1 T₆代转基因水稻中几丁质酶和葡聚糖酶的活力
• 2.2 RCH10和AGLU1在转基因植株中的亚细胞定位
• 3 讨论
• 第四章 荧光显微观察台盼蓝、卡拉唑黑E差异染色水稻叶鞘内、外部纹枯菌菌丝体方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 水稻培养
• 1.1.2 纹枯菌菌株及培养
• 1.1.3 接种纹枯菌的水稻叶鞘
• 1.1.4 载玻片上接种培养纹枯菌
• 1.2 方法
• 1.2.1 荧光增白剂染色
• 1.2.2 苯胺蓝、台盼蓝和卡拉唑黑E染色
• 1.2.3 荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察
• 2 结果
• 2.1 确定以水稻叶鞘内表面作为接种位点和光学显微观察位点
• 2.2 确定用未成熟纹枯菌菌核接种水稻叶鞘
• 2.3 荧光增白剂染色侵染水稻的纹枯菌
• 2.4 苯胺蓝、台盼蓝和卡拉唑黑E分别染色在载玻片上生长的纹枯菌菌丝体
• 2.5 苯胺蓝、台盼蓝和卡拉唑黑E分别染色侵染水稻叶鞘的纹枯菌菌丝体
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介