论文摘要
天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用。虽然用传统的微米级载体对酶进行固定化能提高酶的稳定性,但是,酶在大载体表面变性程度比较大,会使固定化酶活力很低。采用纳米颗粒和酶技术结合制备新型的固定化酶,在提高酶稳定性的情况下可最大限度的保持原有酶活。这种方法简化了工艺、降低了成本、减少了污染,对工业化生产有着极大的意义。本课题研究了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶以不同粒径二氧化硅颗粒为载体制备固定化酶时,pH、酶/载体质量比、载体粒径等对固定化酶性质的影响;之后以胰蛋白酶为模型酶,从动力学角度深入研究固定化后酶生物活性的变化;采用固定化胰蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽（CPPs）,比较特殊条件下和游离胰蛋白酶制备CPPs得率的差异;同时,将这种纳米颗粒吸附对酶分子的保护作用应用到对活性肽CPPs的保护,分析纳米颗粒吸附对CPPs生物活性的影响。主要研究结果如下:（1）酶在二氧化硅颗粒表面的吸附量受pH和载体粒径的影响。在酶和载体等电点之间的pH,吸附量比较高。本研究确定的酶和载体的吸附条件分别是:酶/载体（w/w）=1:1,室温吸附3 h,胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶的最佳吸附pH分别是7.8,6.0和6.0,在该pH下在20 nm二氧化硅颗粒表面对应的吸附量分别是69.0 mg/100mg SiO2,87.3 mg/100mg SiO2和76.9 mg/100mg SiO2。同样条件下,载体粒径越小,酶在其表面的吸附量越高。（2）载体二氧化硅颗粒的粒径对固定化酶的相对活力有显著的影响。固定化酶的相对活力随载体粒径的增加而降低。胰蛋白酶在与微米,300 nm,100 nm和20 nm二氧化硅吸附后相对活力分别是40.7%,46.7%,56.3%和61.4%。木瓜蛋白酶在与微米,300 nm,100 nm和20 nm二氧化硅颗粒吸附后相对活力分别是47.5%,54.1%,58.8%和73.3%。α-淀粉酶在与微米,300 nm,100 nm和20 nm二氧化硅颗粒吸附后相对活力分别是57.5%,61.7%,66.0%和68.1%。除此之外,3种酶固定化后酶的pH和热稳定性也得到了不同程度的提高。pH和热稳定性提高幅度和载体粒径密切相关,同样条件下表现为载体粒径越小,固定化酶pH和热稳定性越强。在90℃处理1 h后,微米二氧化硅和20 nm二氧化硅颗粒固定的胰蛋白酶活力较游离酶分别提高了19.3%和41.6%。在pH 2.0的强酸环境下处理1 h后,微米二氧化硅和20 nm二氧化硅颗粒固定的α-淀粉酶较游离酶分别提高了2倍和2.8倍。（3）固定化后胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶表面疏水性发生了不同程度的变化。并且同等吸附时间时,微米固定化酶表面疏水性要高于纳米固定化酶。吸附3 h后,微米二氧化硅固定化胰蛋白酶和20 nm二氧化硅固定化胰蛋白酶的H0值较游离酶分别提高了25.5%和15.5%;对于木瓜蛋白酶对应的值7.2%和4.2%;α-淀粉酶对应的值18.7%和10.8%。三种酶中,在20 nm二氧化硅表面吸附后,酶活保持率最高的是木瓜蛋白酶,而这种酶表面疏水性的变化幅度也是最小的。表面疏水性的变化幅度和酶活保持率是成负相关的。（4）分别用游离胰蛋白酶和固定化胰蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽（CPPs）。在较强的酸性（pH 2.05.0）、较强的碱性（pH 11.012.0）和高温（60℃80℃）条件下,固定化胰蛋白酶制备CPPs的得率要明显高于游离胰蛋白酶。并且同样条件下,纳米载体固定化胰蛋白酶制备CPPs的得率高于微米载体。在pH 2.0时,微米二氧化硅和20 nm二氧化硅颗粒固定化胰蛋白酶制备CPPs的得率较游离酶分别提高了2.9倍和5.5倍;80℃时,提高的百分比分别是62.9%和35.0%。（5）吸附作用对胰蛋白酶的动力学常数有显著的影响。从动力学的角度可以看出,在极端不良的反应条件下（pH<5.0或温度高于50℃时）,固定化酶开始表现出优势。由于吸附作用尤其是纳米颗粒吸附对酶分子结构的稳定作用,高温和极酸条件下纳米颗粒吸附的酶仍然对底物有较高的亲和能力,保持着较高的反应速度。在80℃,pH 7.8时,微米二氧化硅固定化酶Vm较游离酶提高了13.35%,Km降低了8.81%,而20 nm二氧化硅固定化酶Vm较游离酶提高了23.61%,Km降低了13.09%。在pH 2.0,37℃时,微米二氧化硅固定化酶Vm较游离酶提高了32.76%,Km降低了32.26%,而纳米二氧化硅固定化酶Vm较游离酶提高了47.82%。（6）纳米颗粒的保护作用不仅能作用于酶分子,对活性肽的保护发挥出同样的优势。以CPPs阻止磷酸钙沉淀能力为检验指标,游离CPPs、纳米颗粒吸附CPPs和微米颗粒吸附CPPs分别经过强酸或高温处理后,其阻止磷酸钙沉淀能力表现为:纳米颗粒吸附CPPs>微米颗粒吸附CPPs>游离CPPs。经过pH 3.5的酸处理3 h后,微米二氧化硅和20 nm二氧化硅颗粒吸附的CPPs较游离CPPs阻止磷酸钙沉淀时间分别提高了14.2%和36.8%。而100℃处理1 h后,提高的百分比分别是8.5%和34.2%。这说明二氧化硅颗粒吸附作用能保护CPPs构象的稳定,使CPPs对酸和高温的稳定性大大提高。而且这种保护作用与二氧化硅颗粒的粒径大小有很大关系,在本课题研究的粒径范围内,二氧化硅颗粒越小这种效果也显著。