论文摘要
目的：研究蛙皮胶原蛋白的提取工艺、抗氧化性以及对无水乙醇诱导小鼠胃溃疡的保护作用。方法：本文分别采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶提取蛙皮胶原蛋白并对结果进行比较,选择提取效果最好的酶。采用羟脯氨酸法测定蛙皮中胶原蛋白的含量。通过单因素和正交实验确定最佳提取工艺。采用葡聚糖凝胶色谱法测定胶原蛋白分子量。在胶原蛋白抗氧化性实验中,本文以维生素C作参照考察了胶原蛋白的还原力和羟自由基的清除能力。雄性昆明种小鼠80只,随机分成4组,每组20只,分别为空白组（C）,无水乙醇组（ABE）,西咪替丁组（CIM,52.48 mg/kg）和蛙皮胶原蛋白组（CRC, 60.58 mg/kg）。用生理盐水给空白组和无水乙醇组灌胃,药物组灌胃相应药物,持续10d灌胃,最后一天灌胃后,除了空白组其他组都用0.2mL无水乙醇灌胃。每组中取出一半用来测定溃疡指数,另一半用来测定生化指标,包括丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）和非蛋白巯基（NP-SH）。另取两批小鼠,用L-NAME（或吲哚美辛）预处理,用甘珀酸（CAR）作为阳性对照,其他处理与上述一批一致。用同样的方法测定胃溃疡指数。结果：最佳提取工艺：料液比为1：20,加酶量为1%,pH为5.5于室温反应36 h。此条件下蛙皮胶原蛋白提取率为24.71%,纯度为72.03%。经分子量测定,所有胶原蛋白的分子量都介于200-30000Da之间。胶原蛋白原力和羟自由基清除能力比较弱,12 mg/mL胶原蛋白的还原力相当于0.8 mg/mL的维生素C.对羟自由基的清除能力维生素C大约是胶原蛋白的16倍。药理实验中,与空白组相比,无水乙醇组的溃疡指数明显增大（64.36±4.20vs 0mm2,p<0.01）；与无水乙醇组相比,蛙皮胶原蛋白组和西咪替丁组的溃疡指数明显降低（11.36±1.20,15.03±1.78 vs 64.36±4.20 mm2,p<0.01）.实验结果充分证明了蛙皮胶原蛋白对胃肠具有保护作用。在测定生化指标实验中,与无水乙醇组相比,蛙皮胶原蛋白组明显地增加了NO的含量（7.31±0.157 vs 4.37±0.068, p<0.05）,降低了MDA的含量（0.71±0.017 vs 1.72±0.038,p<0.01）。无水乙醇组,西咪替丁组和蛙皮胶原蛋白组中的谷胱甘肽过氧化物酶、前列腺素E2和非蛋白巯基的含量没有明显的区别。NO对胃溃疡有明显的治疗作用,不加入L-NAME（NO合酶抑制剂）,药物组（西咪替丁和CRCS）明显降低溃疡指数；加入L-NAME,药物组对胃溃疡的治疗作用不明显,说明CRCS是通过上调NO的水平来对胃溃疡起作用的。用吲哚美辛（PGE合酶抑制剂）处理的小鼠,其胃溃疡指数只有胶原组没有明显区别（13±3.04 vs 13.3±1.42,p>0.05）,说明CRCS的抗胃溃疡作用不是通过前列腺素途径起作用的。结论：本实验中胶原蛋白产品的提取率和纯度分别为24.71%和72.03%。蛙皮胶原蛋白的还原力和羟自由基的清除能力比较弱。12 mg/mL胶原蛋白的还原力相当于0.8 mg/mL的维生素C.对羟自由基的清除能力维生素C的ICso为0.654mg/mL,CRCS的ICso为10.32 mg/mL。蛙皮胶原蛋白对无水乙醇诱导的胃溃疡具有一定的保护作用,其机制是增加NO的含量。