枯草芽孢杆菌BS-26菌株的发酵及纤溶酶的分离纯化

论文摘要

血栓性疾病严重威胁人类生命和健康,近年来发病率有增加趋势。溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的治疗手段。目前临床使用的溶栓药物主要是纤溶酶原激活剂类,尽管这些药物的疗效肯定,但还存在许多缺陷,而且价格昂贵。因此研制高效、快速、价廉的新型溶栓药物的需求迫切。本研究的主要目的是对实验室分离保存的纤溶酶产生菌株芽孢杆菌BS-26的发酵产酶条件进行了优化,并研究了该菌株产生的纤溶酶的部分性质及酶的分离纯化。通过对芽孢杆菌BS-26菌株的形态和生理生化特征以及16S rDNA分析,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。对枯草芽孢杆菌BS-26菌株产纤溶酶的液态发酵条件进行优化,首先采用单因子试验,筛选出了最佳碳源为糊精、氮源为酵母粉、无机盐为CaCl2、MgSO4·7H2O,然后设计了这四个因素的三水平正交试验,确定最佳培养基配方为糊精3%、酵母粉1%、CaCl20.02%、MgSO4·7H2O 0.07%;采用单因子试验,优化了发酵工艺参数,最佳培养条件为初始pH7.0,接种量为6%,装液量为70／250（mL／mL）,摇床温度37℃,转速180r／min,发酵时间60h,在该条件下产酶酶活可达593.03U／mL,是原发酵培养条件下产酶活力的4.5倍。用硫酸铵沉淀枯草芽孢杆菌BS-26菌株发酵液中的蛋白质,透析、真空冷冻干燥后用纤维蛋白平板法检测纤溶活性,并对其性质进行了研究。该纤溶酶在50℃以下和pH5.0-11.0范围内具有较好的稳定性,最适作用温度为42℃；最适作用pH值为9.0；Mg2+、Ca2+对此酶有明显的激活作用,而Cu2+能完全抑制酶的活性；1.0 mg／mLPMSF.1.0mg／mLCHOM和10 mg/mLSBTI能完全抑制酶活性,说明此酶属于丝氨酸蛋白酶类；体外溶纤作用表明,该酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。通过硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和聚丙烯酰胺制备电泳等步骤,从该菌株的发酵液中获得了一种纤溶酶组分,比活力达8750U／mg,回收率为3.2%,所获得样品纯度相对于发酵液提高了41倍,该酶在SDS-PAGE中是单肽链蛋白,分子量为32 kDa。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第1章 绪论
• 1.1 血栓性疾病
• 1.1.1 血栓形成和溶解的机制
• 1.1.2 血栓病的预防和治疗
• 1.2 溶栓药物应用状况
• 1.2.1 链激酶
• 1.2.2 尿激酶
• 1.2.3 组织型纤溶酶原激活剂
• 1.2.4 尿激酶原
• 1.2.5 尿甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶复合物
• 1.2.6 葡激酶
• 1.3 纤溶酶类溶栓药物研究状况
• 1.3.1 重组t-PA的突变体等第三代溶栓制剂
• 1.3.2 植物来源的纤溶酶
• 1.3.3 动物来源纤溶酶
• 1.4 微生物源纤溶酶的研究进展
• 1.4.1 细菌来源的纤溶酶
• 1.4.2 真菌来源的纤溶酶
• 1.4.3 放线菌来源的纤溶酶
• 1.5 溶栓药物的研究展望及发展趋势
• 1.6 本研究的目的、意义及主要内容
• 第2章 纤溶酶产生菌株BS-26的鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 BS-26菌株菌体形态观察
• 2.2.2 Bacillus BS-26菌株菌落特征观察
• 2.2.3 Bacillus BS-26菌株生理生化特性测定
• 2.2.4 BS-26菌株的16S rDNA鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 BS-26菌株菌体形态特征观察
• 2.3.2 芽孢杆菌BS-26菌株菌落形态特征观察
• 2.3.3 芽孢杆菌BS-26菌株生理生化特性测定
• 2.3.4 芽孢杆菌BS-26菌株16S rDNA的PCR扩增
• 2.3.5 16S rDNA全序列分析及系统发育树绘制
• 2.4 讨论
• 第3章 B.subtilis BS-26菌株产纤溶酶的液态发酵条件优化
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 B.subtilis BS-26菌株生长曲线的绘制
• 3.2.2 液体种子制备及发酵培养
• 3.2.3 纤溶酶活性的测定
• 3.2.4 培养基组成对发酵产酶的影响
• 3.2.5 发酵工艺条件对产酶的影响
• 3.3 结果
• 3.3.1 B.subtilis BS-26菌株生长曲线的绘制
• 3.3.2 尿激酶活性标准曲线
• 3.3.3 培养基组成对发酵产酶的影响
• 3.3.4 发酵工艺条件对产酶的影响
• 3.3.5 发酵条件优化前后酶活高低的比较
• 第4章 B.subtilis BS-26菌株纤溶酶的性质分析及酶的分离纯化
• 4.1 试验材料与试剂
• 4.1.1 菌种与培养基
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 电泳溶液
• 4.2 主要仪器
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性
• 4.3.2 蛋白质含量的测定
• 4.3.3 B.subtilis BS-26菌株纤溶酶的制备
• 4.3.4 B.subtilis BS-26菌株纤溶酶的性质
• 4.3.5 天然PAGE检测BS-26菌株纤溶酶的组分
• 4.3.6 纤维蛋白-PAGE检测BS-26菌株纤溶酶的活性组分
• 4.3.7 DEAE-Sepharose阴离子交换层析性
• 4.3.8 PAGE制备电泳分离
• 4.3.9 CM-Sepharose阳离子交换层析分离
• 4.3.10 反向层析分离
• 4.3.11 SDS-PAGE测定酶的纯度及相对分子质量
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 蛋白质含量标准曲线
• 4.4.2 B.subtilis BS-26菌株纤溶酶的制备
• 4.4.3 B.subtilis BS-26菌株纤溶酶的性质
• 4.4.4 纤维蛋白-PAGE检测B.subtilis BS-26菌株纤溶酶的活性组分
• 4.4.5 DEAE-Sepharose阴离子交换层析
• 4.4.6 制备PAGE分离
• 4.4.7 SDS-PAGE检测蛋白质的纯度及相对分子质量
• 4.5 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 致谢