驽巴贝斯虫BC-48基因片段在大肠杆菌中的表达与初步应用

论文摘要

驽巴贝斯虫（Babesia caballi）是一种经蜱传播的血液原虫，可引起马属动物发热、贫血、黄疸和水肿，严重的可致死。该病被世界动物卫生组织（0IE）列为B类疫病，给养马业造成了巨大的经济损失。驽巴贝斯虫管状蛋白主要起到侵入红细胞的作用，是抗驽巴贝斯虫裂殖子疫苗的候补蛋白。BC-48基因编码驽巴贝斯虫裂殖子管状蛋白，而且是该虫属比较重要的保守基因。本研究利用PCR技术扩增和克隆了610 bp驽巴贝斯虫中国吉林株BC-48基因片段，对所克隆的BC-48基因序列与基因库中已发表的序列（U46551）进行比较分析。结果表明同源性达到97.1％，证明了该基因片段为驽巴贝斯虫BC-48基因。将BC-48基因克隆至原核表达载体pGgX-4T-2，经酶切鉴定及PCR鉴定，证明成功构建了融合表达载体pGEX-BC48。将构建好的融合表达载体，在1mmol／L的IPTG诱导下，在大肠杆菌BL21中得到大量表达，经过8h表达量达到高峰。融合蛋白GST-BC48的分子量为45ku，大部分以可溶性蛋白的形式存在。用亲和层析方法对GST-BC48融合蛋白进行了纯化，获得了理想的纯化结果。Western-blotting免疫印记分析，融合蛋白与驽巴贝斯虫阳性血清发生特异性反应，而同马巴贝斯虫阳性血清没有交叉反应。说明该蛋白具有很好的抗原性和特异性。本研究应用纯化后的GST-BC48融合蛋白建立了检测驽巴贝斯虫抗体的间接ELISA方法。结果表明，抗原浓度为2.5μg／mL、被检血清稀释度为1：160、酶标二抗稀释度为1：4 000为最佳工作浓度。该方法不与新孢子虫、弓形虫、马巴贝斯虫等阳性血清发生交叉反应，具有较好的特异性；该方法与玄学南等建立的间接ELISA方法平行检测132份马血清样本，结果表明，所建立方法更加敏感。说明建立的ELISA适用于驽巴贝斯虫抗体的检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 一、弩巴贝斯虫病原学研究进展
• 二、弩巴贝斯虫病流行病学及危害
• 三、鸳巴贝斯虫主要抗原及弩巴贝斯虫病防治研究进展
• 四、本研究目的及意义
• 试验研究
• 1 试验材料
• 1.1 病料
• 1.2 载体与菌株
• 1.3 主要试剂
• 1.4 试验所用溶液及其配制
• 1.5 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 驽巴贝斯虫基因组DNA的制备
• 2.2 引物的设计与合成
• 2.3 目的基因的PCR扩增
• 2.4 PCR产物的回收
• 2法）'>2.5 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.6 BC-48 DNA与pGEM-T Easy载体的重组连接
• 2.7 重组连接后质粒DNA的转化
• 2.8 重组克隆的筛选
• 2.9 质粒DNA的小量制备（碱性裂解法）
• 2.10 重组质粒的鉴定
• 2.11 序列测定及分析
• 2.12 重组表达载体的构建
• 2.13 重组表达载体的鉴定
• 2.14 重组融合表达质粒的诱导表达
• 2.15 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.16 融合蛋白Western-blotting分析
• 2.17 重组蛋白的大量表达
• 2.18 包涵体的鉴定
• 2.19 亲和层析法纯化融合蛋白（Batch法）
• 2.20 BC-48融合蛋白的初步应用——ELISA试验
• 3 试验结果
• 3.1 PCR扩增
• 3.2 目的基因的克隆及重组质粒的鉴定
• 3.3 BC48-easy重组质粒的序列测定及同源性分析
• 3.4 重组表达载体的构建及鉴定
• 3.5 重组表达质粒的序列测定及分析
• 3.6 重组表达载体pGEX-BC48的表达
• 3.7 融合蛋白Western-blotting分析
• 3.8 蛋白存在形式的鉴定
• 3.9 重组蛋白的亲和层析纯化
• 3.10 以重组BC-48蛋白为抗原的ELISA试验
• 4 讨论
• 4.1 驽巴贝斯虫病的诊断
• 4.2 BC-48基因片断的克隆与扩增
• 4.3 酶切鉴定
• 4.4 影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素
• 4.5 高效融合表达载体pGEX-4T-2的选择
• 4.6 BC-48重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 4.7 Western—blotting检测重组蛋白的特异性
• 4.8 以重组BC-48蛋白为抗原的ELISA试验
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录（攻读学位期间发表论文目录）