中药中抑制α-葡萄糖苷酶活性组分的研究

论文摘要

α-葡萄糖苷酶广泛存在于生物体中,不仅是生物体正常运转的关键酶,而且是许多疾病的相关酶。以α-葡萄糖苷酶为靶标,从传统中药中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂,对新药的开发和中药的现代化有着巨大的推动作用。论文根据当前筛选中存在的不足,进行了以下两个实验：以对-硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷为底物,利用高效液相色谱定量分析水解产物对-硝基苯酚,确定α-葡萄糖苷酶的活性,通过单因素实验,建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的体外筛选模型：10 μL 0.067 mol·L-1, pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液或待筛选溶液、30μL0.1U·mL-1 α-葡萄糖苷酶,震荡混匀,37℃孵育20 min,加入40μL 8.0 mmol·L-1 PNPG开启反应,震荡混匀,37℃反应30 min后,加入80 μL 0.2 mol·L-1 Na2CO3终止反应,加超纯水稀释至5001μL,振荡混匀,经0.451μm膜过滤后,用HPLC检测,通过产物PNP的浓度变化,计算a-葡萄糖苷酶的活性。通过Acarbose验证了筛选方法的可靠性,说明该方法微量、准确、灵敏、快速,可降低筛选的假阳性,提高从复杂样品或有色素干扰样品中发现新的活性物质的机率。选择对糖尿病有治疗作用的50味中药,用5种溶剂（正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、水）对50味中药进行系统提取,建立了含有250个提取部位的组分库并应用建立的筛选模型,首次应用高效液相色谱研究了各个提取部位在3个浓度（64、6.4、0.64 mg·mL-1）下的a-葡萄糖苷酶抑制活性。通过筛选,确定了对α-葡萄糖苷酶有较大抑制活性的中药和中药组分,总结了活性组分在中药中的存在规律和性质,为中药资源的开发利用提供了重要的活性数据参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 α-葡萄糖苷酶
• 1.1.1 α-葡萄糖苷酶的理化性质
• 1.1.2 α-葡萄糖苷酶的催化机制
• 1.1.3 α-葡萄糖苷酶的生物学功能
• 1.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂
• 1.2.1 酶抑制剂的动力学类型
• 1.2.1.1 可逆抑制作用
• 1.2.1.2 不可逆抑制作用
• 1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用
• 1.2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制剂与糖尿病
• 1.2.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂与肥胖
• 1.2.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制剂与艾滋病
• 1.2.2.4 α-葡萄糖苷酶抑制剂与肝硬变
• 1.2.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制剂与胃切除后的倾倒综合病
• 1.2.2.6 α-葡萄糖苷酶抑制剂与肿瘤
• 1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制剂的副作用
• 1.2.4 临床应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂
• 1.2.4.1 米格列醇（miglitol）
• 1.2.4.2 阿卡波糖（acarbose）
• 1.2.4.3 伏格列波糖（voglibose）
• 1.2.4.4 1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin,DNJ）
• 1.3 高通量筛选
• 1.3.1 高通量筛选在中药研究中的应用
• 1.3.1.1 中药有效成分的研究
• 1.3.1.2 中药有效部位的研究
• 1.3.1.3 中药复方的研究
• 1.3.1.4 中药作用机理研究
• 1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型
• 1.3.2.1 体内筛选模型
• 1.3.2.2 体外筛选模型
• 1.3.3 中医治疗糖尿病的研究进展
• 1.3.3.1 中医对糖尿病的认识
• 1.3.3.2 中医治疗糖尿病的单味中药
• 1.3.3.3 中医治疗糖尿病的复方
• 1.4 本课题的研究内容、目的及意义
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 研究目的及意义
• 第二章 α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选模型的建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 试剂与溶液配制
• 2.1.2.1 试剂
• 2.1.2.2 溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
• 2.2.2 PNP的HPLC定量分析
• 2.2.3 酶稳定性研究
• 2.2.4 酶促反应条件的优化
• 2.2.4.1 终止剂用量的选择
• 2.2.4.2 酶浓度的选择
• 2.2.4.3 反应时间的选择
• 2.2.4.4 底物浓度的选择
• 2.2.4.5 孵育时间的选择
• 50的测定'>2.2.5 Acarbose的IC₅₀的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 PNP标准工作曲线
• 2.3.2 精密度实验
• 2.3.3 重复性实验
• 2.3.4 温度的选择
• 2.3.5 pH的选择
• 2.3.6 放置时间对酶活性的影响
• 2.3.7 酶促反应条件的优化
• 2.3.7.1 终止剂浓度对酶活性的影响
• 2.3.7.2 酶浓度对反应速率的影响
• 2.3.7.3 水解时间对反应速率的影响
• 2.3.7.4 底物浓度对反应速率的影响
• 2.3.7.5 孵育时间对酶抑制活性的影响
• 2.3.8 模型验证
• 2.4 结论
• 第三章 50味中药抑制α-葡萄糖苷酶作用研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 中药
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 筛选对象的确立
• 3.2.2 中药提取物的制备
• 3.2.3 提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
• 3.2.4 溶解试剂的选择
• 3.2.5 中药提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 中医治疗糖尿病常用中药
• 3.3.2 组分库的建立
• 3.3.3 有机试剂对α-葡萄糖苷酶活性的影响
• 3.3.4 50味中药对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
• 3.4 结论
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录