重组SARS-CoV S蛋白表位肽疫苗的研究

论文题目: 重组SARS-CoV S蛋白表位肽疫苗的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 免疫学

作者: 林剑萍

导师: 于永利

关键词: 冠状病毒,疫苗,抗体,表位,体液免疫

文献来源: 吉林大学

发表年度: 2005

论文摘要: 2002～2003 年爆发流行的传染性非典型肺炎（SARS）共造成29 个国家的8098 例感染,774 例死亡,引起了广泛关注。SAR.S 相关冠状病毒（SAR.S.CoV）是SARS 的病原体。棘突蛋白（S 蛋白）是SARS—CoV 的外壳成分,为SARS-CoV 识别和结合宿主细胞的关键结构,可以诱生SAR.S.CoV 的中和抗体,因此可作为抗SARS.CoV 药物及疫苗研究的靶点。为了研制预防SARS 疾病的疫苗,我们采用生物信息学方法对S 蛋白结构和特性做预测,选定了可能包含B 淋巴细胞表位区为168aa-216aa 肽段（S2）和726aa.843aa 肽段（S6）。在此基础上,构建出S2基因六聚体（PS2基因）和分子伴侣10-s6融合基因（C86 基因）,采用大肠杆菌高效表达了重组PS2和CS6蛋白,并用Ni2+亲合层析方法获得了纯化的重组蛋白。重组PS2 蛋白在小鼠诱生的高滴度抗体以IgGl 为主,可识别SARS-CoV S 蛋白的S1 亚单位全长多肽（S1 多肽）和灭活的SARS—CoV。此外,重组PS2蛋白能在体外刺激被重组PS2蛋白免疫的小鼠脾细胞和B 淋巴细胞发生记忆性增殖并产生S1 多肽特异性抗体,促进小鼠产生IL-6,并可诱导未致敏人PBMC 增殖和B 细胞活化。结果提示,重组PS2 蛋白可能诱生SARS-CoV 的中和抗体,因而成为一种新型的抗SARS 疫苗。

论文目录:

英文缩写词表

前言

文献回顾

1. SARS 爆发和冠状病毒

2. 流行病学

3. 临床特点

4. SARS-CoV 的基因组特点

5. SARS-CoV 基因组编码的蛋白质分析及预测

6. SARS-CoV 基因组的变异分析

7. SARS-CoV 的生活周期、致病机理及发病机制

8. 抗SARS-CoV 药物的研究现状

9. 有待深入研究的问题

材料与方法

1 实验材料

1.1 试剂

1.2 质粒与菌株

1.3 实验动物

1.4 引物

1.5 培养基

1.6 仪器设备

2 实验方法

2.1 S 蛋白B 细胞表位抗原区的预测及疫苗结构设计

2.2 利用PCR 法合成S_2和S_6基因片段

2.3 DNA 片段的TA 克隆及测序

2.4 pMD-18T-PS_2重组质粒的构建

2.5 重组质粒亚克隆入pET28a 表达载体

2.6 重组蛋白的表达、纯化

2.7 重组蛋白免疫小鼠和多克隆抗体制备

2.8 Western blot

2.9 间接ELISA 法检测抗体效价

2.10 Immuno-dot blot

2.11 灭活的SARS-CoV IgG 抗体检测试剂盒检测抗体

2.12 抗体分型和上清中抗51 抗体的检测

2.13 血清中细胞因子的定量检测

2.14 小鼠脾细胞的分离培养

2.15 人PBMC 的分离培养

2.16 3H-TdR 掺入实验

2.17 CFSE 染色和FACS 分析

2.18 重组蛋白对人外周血B 细胞活化的检测

2.19 统计分析

实验结果

1. S蛋白B细胞表位抗原区的预测及疫苗设计

2. PS_2和CS_6基因的构建及重组蛋白的表达、纯化和鉴定

3. 重组PS_2和CS_6蛋白的抗原性分析

4. 重组PS_2蛋白诱导的识别SARS-CoV 抗体的检测

5. 重组PS_2蛋白诱生小鼠抗体的型别分析

6. 重组PS_2蛋白免疫小鼠脾细胞培养上清中抗体的检测

7. 重组PS_2蛋白免疫小鼠血清中细胞因子的检测

8. 重组PS_2蛋白对小鼠脾细胞及B 细胞特异性增殖的诱导作用

9. 重组PS_2蛋白对人PBMC 增殖及B 细胞活化的诱导作用

图和照片

讨论

结论

参考文献

攻读博士学位期间已或待发表的文章

创新性声明

中文摘要

ABSTRACT

致谢

发布时间: 2005-08-26

重组SARS-CoV S蛋白表位肽疫苗的研究

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