论文摘要
背景与目的人巨细胞病毒UL49开放阅读框（ORF）为疱疹病毒保守基因。目前,除Walter Dunn等利用细菌人工重组染色质（BAC）技术发现UL49缺失突变病毒不能再包装,间接证实UL49为人巨细胞病毒生长的必须基因外,对UL49相应功能研究均局限于生物信息学分析与推测。为了进一步证实UL49在病毒生物学方面的功能,有必要首先阐明以下问题：UL49的mRNA表达及全长cDNA精确序列；能否检测到UL49编码的蛋白（pUL49）、确定pUL49表达时相及蛋白特性（病毒结构蛋白、还是非病毒结构蛋白?）等；在此基础上,对以下问题进行实验论证：pUL49在病毒感染宿主细胞中的定位以及在病毒感染、复制中的生物学功能；pUL49可能与宿主细胞哪些蛋白分子相互作用等。方法将HCMVA接种生长良好的人胚肺成纤维细胞（HELF）,抽提病变细胞中的病毒RNA;以SMART RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE）技术扩增UL49的5’和3’末端,TA克隆两类RACE产物,测序；用RT—PCR扩增UL49全长cDNA序列。获取Genebank公布的UL49编码氨基酸序列,用在线软件对其Hopp&Woods亲水性、可及性、极性及柔韧性、Welling抗原性和二级结构等参数法进行分析,用吴玉章等建立的B细胞表位预测法综合评价；以化学方法对预测片断进行多肽合成、纯化、与载体血兰蛋白（KLH）联接；将多肽-血兰蛋白化合物（免疫原）免疫新西兰大白兔,获得兔免疫血清后,用ELISA测定效价；构建HCMV UL49大片断（aa3-246）原核表达载体pGEX-4T-3-UL49A,诱导表达pUL49A-GST融合蛋白；构建HCMV UL49全基因真核表达载体pCDNA3.1-UL49-myc,瞬时表达pUL49-myc融合蛋白；以包装成功的HCMV-Towne病毒株感染HFF细胞,收集7天后的培养上清液,以anti-HCMV pUL49为一抗进行上述三种样本Western blotting实验。以RV-Towne感染HFF,收集3、6、12、24、48、72、96、120hr后细胞裂解液,以anti-HCMV pUL49、anti-IE （CMVpp72/86）、anti-E （CMVgB/CH28）、anti-LA （CMVpp28/CH19）分别对细胞裂解上清液进行WB；收集接近100%细胞病变的HFF[RV-Towne]培养上清液（病毒颗粒）,于58750×g、4℃离心纯化病毒,分别用Triton X-100、Trypsin预处理并4℃、100000g离心,以可溶混合上清液、不溶蛋白部分分别进行Western blotting。用试剂盒抽提、纯化重组人巨细胞病毒Towne基因组（Towne-BAC）、delUL49 Towne基因组（delUL49 Towne-BAC）,构建pcDNA3.1（+）-UL82表达质粒；将Towne-BAC、delUL49 Towne分别与pcDNA3.1 （+）-UL82共转HFF,将Towne-BAC、delUL49 Towne分别与pcDNA3.1 （+）-UL82、pcDNA3.1 （+）-UL49共转HFF,培养病毒、观察细胞病变；以RV-Towne感染HFF,收集3、6、12、24、48、72、96、120hr后细胞,分别用Hochest33258、anti-HCMVpUL49、anti-E、anti-LA进行细胞免疫影像实验,荧光显微镜下观察、影像合成定位分析；将纯化的重组病毒与anti-pUL49抗体经37℃预处理0.5hr后,以1 PFU／cell量感染HFF细胞,收集1-7天的病毒细胞上清夜,再观察其生长状况；将上述预处理RV-Towne以1 PFU／cell量感染HFF细胞,收集1、3、6hr的病毒感染细胞,抽提总染色质DNA,以连续稀释后的总染色质DNA为模板,PCR扩增RV-Towne特异基因IE1序列,半定量分析RV侵入细胞的量。扩增UL49全序列,克隆入pGBKT7,将pGBKT7-UL49转化到酵母细胞AH109,用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应；将人胚肾细胞cDNA文库与pGBKT7-UL49共转AH109,于营养缺陷型培养基中筛选阳性克隆,按文献将阳性克隆酵母作β-半乳糖苷酶活性测定；将酵母质粒电转DH5α,抽提质粒,设计文库插入片段上游引物,对双杂交阳性且β-半乳糖苷酶阳性细菌质粒的AD插入片段进行PCR；将非重复克隆细菌质粒的AD插入片段PCR扩增产物进行HaeⅢ酶切,将非重复克隆质粒进行测序,通过Genebank同源性搜索和序列比对分析；选取同源性搜索和序列比对分析后的基因重复酵母双杂交及其β-半乳糖苷酶活性实验；扩增CYB5D2、C11ORF17、COL3A1、UCHL3因片断,构建其pGEX4T-3的表达质粒,构建pCDNA3.1（+）-UL49真核表达质粒；用IPTG诱导细菌表达CYB5D2、C11ORF17、COL3A1、UCHL3的GST融合蛋白,瞬时表达pUL49蛋白,按文献将pUL49分别与CYB5D2、C11ORF17、COL3A1、UCHL3的GST融合蛋白进行GST-pull down；构建pCDNA3.1（+）-COL3A1、pCDNA3.1（+）-C11ORF17真核表达质粒,分别瞬时转染HFF细胞,以1.0PFU/cell量感染上述两组细胞,收集感染1-7后的细胞培养上清夜进行病毒生长实验。结果HCMVA在体外成功感染HELF,感染的HELF中有HCMV的IE1和LA标志性基因；用SMART RACE技术从病毒RNA中获得UL49基因的5’和3’UTR,分别克隆后测序,UL49基因5’UTR长90bp、3’UTR长315bp；RT-PCR扩增获得2118bp的UL49基因全长cDNA序列,其开放读码框编码570个氨基酸。多种预测法重复了人巨细胞病毒pUL49蛋白的N端第228～243位氨基酸区域内或附近,该区域含有β转角和无规卷曲结构；化学方法合成得到了该区域氨基酸序列KRFDARADLAVY-KLH的免疫原；获得免疫兔血清,ELISA测定效价达1：8000以上；以此anti-HCMV pUL49为一抗得WB实验显示pUL49A-GST融合蛋白、pUL49A-myc融合蛋白、HFF[RV-Towne]细胞蛋白裂解液均显示蛋白条带,其分子量与理论值吻合。RV-Towne感染HFF在12hr后,pUL49开始出现表达,至RV-Towne感染96hr达峰值,与典型的HCMV时相基因pp72／86、gB、pp28的表达对照,类似gB蛋白时相；用细胞表面活性剂TX-100以及蛋白胰酶对纯化病毒进行不同处理后,pUL49与pp28的WB实验结果一致,而与gB存在明显差异。成功构建pcDNA3.1（+）一UL82.pcDNA3.1（+）-UL49；Towne-BAC与pcDNA3.1（+）-UL82共转15天后可见绿色荧光,delUL49 Towne-BAC与pcDNA3.1（+）-UL82共转30天后仍未见绿色荧光；Towne-BAC与pcDNA3.1（+）-UL82、pcDNA3.1（+）-UL49共转15天后也可见绿色荧光,delUL49 Towne-BAC与pcDNA3.1（+）-UL82共转20天后方见绿色荧光,至30天后荧光强度仍较Towne-BAC的结果相距甚远；病毒感染HFF细胞过程中,pUL49出现时间与蛋白表达出现时间一致,均出现于12hr,影像显示pUL49定位于细胞质而非细胞核,且在细胞感染24hr内显现均匀散布状,而后渐成聚集状,定位于核外边界某一点状区域、且量逐渐增多；以早期表达蛋白gB、晚期表达蛋白pp28为对照,pUL49与pp28在72、96hr存在共定位,而与gB虽然在24、72、96hr均出现表达影像,但未发现两者之间的共定位；经anti-pUL49预处理的重组病毒在感染前2天与未经处理的病毒出现近1个数量级的生长差异,两者在其后的差异均在1个数量级内,差异并不明显；anti-pUL49预处理的病毒在感染侵入阶段（1-6hr）,RV-Towne特异基因IE1序列PCR扩增产物与未经anti-pUL49预处理的病毒差异不显著。克隆成功pGBKT7-UL49并成功转化到AH109,AH109[pGBKT7-UL49]表达诱饵蛋白pUL49,pUL49对转化细胞无细胞毒性、无自激活；酵母双杂交筛选得到30个SD／-Trp-Leu-His-Ade阳性且β-半乳糖苷酶阳性克隆,PCR、HaeⅢ酶切鉴定结果显示11个非重复克隆质粒；其中4个基因重复酵母双杂交及其β-半乳糖苷酶活性,显示C11ORF17、COL3A1表达蛋白与pUL49间的相互作用相对较强；诱导细菌表达pGEX4T-3-CYB5D2、pGEX4T-3-C110RF17、pGEX4T-3-COL3A1、pGEX4T-3-UCHL3的GST融合蛋白与pUL49瞬时表达蛋白相互对应的GST-pull down,结果显示C11ORF17、COL3A1出现条带呈现阳性结果,而CYB5D2、UCHL3未出现条带；pC11ORF17表达的宿主细胞实验组重组病毒生长受到一定抑制,而pCOL3A1表达的宿主细胞实验组重组病毒生长与未处理组无显著差异。结论在体外HCMVA感染过程中,UL49的mRNA存在表达,其cDNA序列全长共2118bp,其中5’UTR长90bp,3’UTR长315bp,UL49开放阅读框编码570个氨基酸。多种预测法重复了pUL49蛋白的N端第228-243位氨基酸区域内或附近为B细胞识别区；用化学合成得到KRFDARADLAVY-KLH免疫原,获得效价高、特异性强的兔anti-HCMV pUL49抗血清。人巨细胞病毒UL49开放阅读框编码蛋白在病毒感染过程中存在表达,且pUL49为早期表达蛋白；pUL49与pp28对TX-100、蛋白胰酶的耐受相近,暗示两者定位于病毒颗粒同一区域（皮层）pUL49为Towne的生长必需基因；在表达pUL49的HFF细胞中,缺失UL49的Towne能部分得到回复生长；病毒感染过程pUL49定位于细胞质而非细胞核,随感染时间的持续有被招募于宿主细胞特定区域的趋势；pUL49与pp28在72、96hr存在共定位,暗示pUL49在感染晚期定位于细胞内质网；在病毒增殖过程中,anti-pUL49影响了病毒生长速度,但在感染过程中,未影响病毒的侵入环节。成功构建了酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL49,经双杂交系统筛选,成功获得11个非重复克隆质粒；其中C110RF17、COL3A1表达蛋白与pUL49间的相互作用相对较强；GST-Pull down验证了该两个蛋白与pUL49的体外相互作用；pUL49与pC110RF17的相互作用可能影响病毒的增殖与生长,而pUL49与pCOL3A1的相互作用对病毒的增殖与生长基本无影响。
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