水稻光合功能相关性状QTL分析及转绿型白叶突变体基因的图位克隆

论文摘要

随着世界人口的不断增长，粮食短缺已成为本世纪全球最严重的问题之一。水稻提供了半数以上世界人口的食粮，其产量的提高必然是解决未来全球粮食危机的有效途径之一。光合作用及相关生理性状是决定产量的重要因素。叶色突变体是开展光合生理研究的理想材料。本研究利用3个定位群体为材料，检测控制水稻光合功能相关生理性状QTL。同时以转绿型白叶突变体玉兔S为材料，开展了光合生理研究，并自行开发了分子标记精细定位和图位克隆了突变基因，从而为水稻高光效生理育种的分子改良和转绿型白叶突变体在生产上应用奠定了理论基础。主要结果如下：1利用重组自交系群体检测水稻光合功能相关性状QTL利用粳稻Kinmaze／籼稻DV85杂交后代单粒传衍生的81个F11家系所组成的重组自交系群体，研究水稻光合功能相关性状的数量性状基因座（QTL）。在水稻抽穗后7d测定叶片全氮含量（TLN）、叶绿素a／b比值（Chl．a：b）和叶绿素含量（Chl），共检测到6个QTL，各QTL的LOD值为2.66～4.81，贡献率为11.2～29.6％。其中，在第1、2和11染色体上检测到3个与全氮含量相关的QTL，相应贡献率为17.3％、15.3％、13.7％；在第3和4染色体上检测到2个与叶绿素a／b比值相关的QTL，贡献率为13.8％和29.6％；在第1染色体上检测到1个与叶绿素含量相关的QTL，贡献率为11.2％。4个QTL为本研究新检测的基因座。有趣的是，控制叶绿素含量的qCC-1，位于第1染色体上RFLP标记C122附近，与已报道的NADH-谷氨酸合成酶基因位置一致，而叶绿素合成始于谷氨酸，暗示该基因座与水稻光合功能关系极为密切。然而，对抽穗后30d叶绿素含量进行QTL分析，结果未检测到与其相关的QTL，表明控制叶绿素含量qCC-1效应随水稻叶片的衰老而降低。2利用回交重组自交系群体检测水稻光合功能相关性状QTL利用98个家系组成的日本晴（粳稻）／Kasalath（籼稻）∥日本晴回交重组自交系群体(BC1F10)，研究水稻光合功能相关性状的数量性状基因座（QTL）。在水稻抽穗后7d测定叶片全氮含量（TLN）、叶绿素a／b比值（Chl．a：b）和叶绿素含量（Chl），共检测到8个QTL，各QTL的LOD值为2.61～6.42，贡献率为9.7～21.0％。其中，在第1和6染色体上检测到2个与全氮含量相关的QTL，相应贡献率为9.7％、10.8％；在第2、3和12染色体上检测到3个与叶绿素a／b比值相关的QTL，贡献率为10％、10.5％、21％；在第1、4和8染色体上检测到3个与叶绿素含量相关的QTL，贡献率为13.7％、10.7％、10％。有趣的是，此群体检测的qCC-1，也位于第1染色体上RFLP标记C122附近，进一步表明该基因座对水稻光合功能的重要性。对抽穗后30 d叶绿素含量进行QTL分析，结果在第4和6染色体上检测到2个QTL与其相关，而位于标记C122附近的qCC-1也未被检测到，从而进一步暗示此位点的效应随水稻叶片的衰老而降低。3利用染色体片段置换系群体检测水稻光合作用及相关生理性状QTL利用由籼稻品种IR24和粳稻品种Asominori杂交衍生的Asominori染色体片段置换系群体为材料，研究了水稻光合作用及相关生理性状的QTL。在水稻抽穗后7 d测定叶片光合速率（PHO）、蒸腾速率（TR）、气孔导度（SCO）、胞间CO2浓度（IC）、叶绿素含量（CHL）、全氮含量（TLN）。共检测到10个QTLs，分布于第1、3、4、5、7、8和10染色体上，LOD值在2.77～8.42之间，贡献率变幅为9.5～46.5％。其中仅有控制气孔导度的qSCO-8与控制叶绿素含量的gCHL-8以及第10染色体上控制气孔导度的gSCO-10与控制胞间CO2浓度的gIC-10位置相同，分别位于第8染色体上标记R727和第10染色体上标记C1166附近。其它QTL在染色体上的位置不同，暗示水稻光合功能遗传机理的复杂性。4水稻转绿型白叶突变体基因的图位克隆利用一个由60Co-γ射线诱变得到的水稻转绿型白叶（vwl）突变体玉兔S为材料，其在2叶1心期前表现白化，以后慢慢转绿，恢复正常生长。对突变体的光合色素、叶绿体显微结构及突变基因克隆进行了比较系统的研究，得到以下结果：（1）光合色素测定结果显示，转绿前突变体叶片中无法正常合成叶绿素a、叶绿素b、β-类胡萝卜素；转绿后上述3种光合色素合成正常。表明突变体苗期白化是由总的光合色素减少所致。（2）转绿前后的叶绿体电镜显微观察表明，转绿前突变体细胞内完全丧失了叶绿体结构，只有一些类似前质体的结构；转绿后突变体细胞内具有正常的叶绿体结构，含有丰富的类囊体。（3）遗传分析表明，该突变属于单基因隐性突变。（4）利用公共图谱上SSR分子标记和F2群体中672个突变体单株对突变基因进行了初步定位。结果表明，突变基因位于第3染色体上标记RM411和RM6832之间，距离分别为1.1cM和1.2cM。（5）利用根据水稻基因组数据自行开发的SSR、CAPS以及dCAPS分子标记和F2群体中2240个突变体单株，构建了FWL基因区域高密度遗传图谱和BAC重叠群，最终将突变基因定位在标记P45和D8之间的45kb范围内，与标记P50共分离。（6）对定位区域内所有潜在的基因进行分析，发现在预期的目标基因位置存在一个编码假定PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白的基因（暂命名为OsPPR2）。已知PPR蛋白属于RNA结合蛋白一类，控制叶绿体mRNA的稳定或翻译。因此，这个基因应是vwl的一个候选基因。测序结果显示，突变体中该基因编码区有一个5bp的缺失。基于缺失设计的InDel标记I1分析F2群体中的2240个突变体单株和20个正常叶色的水稻品种，结果表明标记I1与vwl共分离。由此可以初步认为，OsPPR2就是VWL。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 引言
• 第一节 水稻光合功能相关性状QTL定位研究进展
• 1 QTL定位研究的原理、方法与应用
• 1.1 水稻DNA分子标记连锁图的构建
• 1.2 QTL定位群体
• 1.3 QTL定位原理及分析方法的发展
• 1.4 QTL定位统计软件和阈值
• 1.5 从QTL到基因
• 1.6 QTL定位在水稻育种中的应用
• 2 水稻光合功能相关性状QTL定位的研究进展
• 2.1 叶片全氮含量QTL
• 2.2 叶绿素含量QTL
• 2.3 叶绿素a/b比值QTL
• 2.4 净光合速率QTL
• 2.5 蒸腾速率QTL
• 2.6 气孔导度QTL
• 2浓度QTL'>2.7 胞间CO₂浓度QTL
• 2.8 与光合功能相关的其它生理性状QTL
• 2.9 水稻光合功能相关性状QTL定位研究存在的问题
• 第二节 水稻叶色突变体研究现状
• 1 水稻叶色突变体的类型、表现及相关生理机制
• 1.1 叶色突变体的类型
• 1.2 叶色突变体的表现及相关生理机制
• 2 叶色突变体的产生方法
• 3 叶色突变体的遗传规律
• 4 叶色突变发生的分子机制
• 4.1 四吡咯生物合成受阻
• 4.2 叶绿体分化受阻
• 4.3 质—核信号转导途径受阻
• 4.4 叶绿体蛋白转运受阻
• 4.5 其它与光系统无直接相关的基因突变
• 5 水稻叶色突变体的分子生物学研究
• 5.1 水稻叶色突变基因遗传定位
• 5.2 水稻叶色突变相关基因的克隆
• 5.3 叶色突变相关基因的表达调控
• 6 水稻突变体基因的图位克隆
• 7 水稻叶色突变体的应用价值
• 7.1 叶色突变可作为标记性状应用于水稻杂交育种
• 7.2 叶色突变可作为形态标记应用于基因定位
• 7.3 叶色突变在高光效育种中的应用
• 7.4 叶色突变在光形态建成研究中的应用
• 7.5 叶色突变在叶绿素合成代谢和叶绿体发育研究中的作用
• 7.6 叶色突变在研究质—核信号传导途径中的作用
• 第三节 本研究的目的和意义
• 第二章 利用重组自交系群体检测水稻光合功能相关性状QTL
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 光合功能相关性状的测定
• 1.3 连锁图谱构建和QTL检测
• 2 结果
• 2.1 光合功能相关性状在亲本及RIL群体中的表现
• 2.2 QTL分析
• 2.2.1 全氮含量
• 2.2.2 叶绿素a/b比值
• 2.2.3 叶绿素含量
• 3 讨论
• 第三章 利用回交重组自交系群体检测水稻光合功能相关性状QTL
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 光合功能相关性状的测定
• 1.3 连锁图谱构建和QTL检测
• 2 结果
• 2.1 光合功能相关性状在亲本及BIL群体中的表现
• 2.2 QTL分析
• 2.2.1 全氮含量
• 2.2.2 叶绿素a/b比值
• 2.2.3 叶绿素含量
• 3 讨论
• 第四章 利用染色体片段置换系群体检测水稻光合作用及相关生理性状QTL
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 田间种植
• 1.3 性状测定
• 1.3.1 光合参数测定
• 1.3.2 叶绿素与全氮含量的测定
• 1.4 相关分析与QTL检测
• 2 结果与分析
• 2.1 光合作用及相关生理性状的表型分布
• 2.2 性状间的相关性分析
• 2.3 QTL分析
• 3 讨论
• 第五章 水稻转绿型白叶突变体基因的图位克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料种植
• 1.2 DNA提取
• 1.3 分子标记检测
• 1.3.1 试剂
• 1.3.2 SSR标记分析中PCR反应
• 1.3.3 SSR标记的PCR产物检测
• 1.4 突变基因定位
• 1.4.1 突变基因初步定位
• 1.4.2 突变基因的进一步定位
• 1.4.3 利用水稻基因组数据自行开发SSR标记
• 1.4.4 利用水稻基因组数据自行开发CAPS、dCAPS标记
• 1.5 遗传作图
• 1.6 候选基因的获得
• 1.7 光合色素测定
• 1.8 叶绿体透射电镜
• 2 结果
• 2.1 突变体的表型鉴定及叶绿体TEM分析
• 2.2 遗传分析
• 2.3 初步定位
• 2.4 精细定位
• 2.5 VWL的候选基因鉴定及初步验证
• 3 讨论
• 3.1 水稻苗期转绿型白叶突变体基因的精细定位
• 3.2 图位克隆中候选基因的筛选和鉴定
• 3.3 叶绿体发育与叶片发育过程中质-核基因间的精细调控
• 第六章 全文小结
• 1 全文结论
• 1.1 利用重组自交系群体检测水稻光合功能相关性状QTL
• 1.2 利用回交重组自交系群体检测水稻光合功能相关性状QTL
• 1.3 利用染色体片段置换系群体检测水稻光合作用及相关生理性状QTL
• 1.4 光合功能相关性状QTL分析总结
• 1.5 水稻转绿型白叶突变体基因的图位克隆
• 2 本研究的创新之处
• 2.1 水稻光合功能相关性状QTL分析
• 2.2 克隆到水稻PPR家族的新基因
• 参考文献
• 附表
• 致谢
• 博士在读期间发表（投稿）的相关论文