论文摘要
第一部分恶性高热实验室诊断方法的建立目的建立恶性高热（Malignant Hyperthermia,MH）的实验室诊断方法-咖啡因-氟烷骨骼肌收缩试验（Caffeine and halothane contracture test,CHCT）。方法根据北美MH研究组的标准建立CHCT的试验装置后,通过10头实验小型猪和1头皮特兰猪检测CHCT设备的稳定性及结果的可靠性。1.MH诱发实验:应用氯胺酮和安定进行基础麻醉后,静脉给予硫喷妥钠和琥珀胆碱（2mg/kg）进行气管插管,成功后机控呼吸并持续吸入2～3%氟烷（氧气:空气=1:1）维持麻醉;观察所有实验动物是否出现MH的典型表现;2.基因检测:取猪的耳组织,采用常规酚氯仿方法,提取基因组DNA,设计特异性引物PCR扩增RYR1基因的突变热点区域,取PCR产物经HhalI限制性内切酶进行酶切分析;3.CHCT:取猪股四头肌近肌腱部位的肌纤维2～3cm,固定于37℃恒温Krebs液内并持续通入含5%二氧化碳的氧气,连接张力传感器和电刺激仪,给予一定电刺激,测定不同浓度氟烷（和/或咖啡因）下肌肉收缩张力的改变。结果1.MH诱发实验:所有实验小型猪的MH诱发实验过程平稳,均未出现MH发作的表现;皮特兰猪在MH诱发实验后出现四肢僵直、PaCO2及体温升高、CK升高、肌红蛋白尿等MH的临床表现。2.基因检测:实验小型猪均为氟烷抗性基因型HALNN,皮特兰猪为氟烷易感基因型HALnn。3.CHCT:所有实验小型猪的咖啡因试验和氟烷试验均为阴性,符合非MH易感猪的诊断;皮特兰猪的咖啡因试验和氟烷试验均为阳性,符合MH易感猪的诊断。结论本研究中,实验小型猪和皮特兰猪的CHCT诊断结果与MH诱发实验的临床表现及基因检测结果均一致,初步验证本实验室CHCT设备的稳定性及结果的可靠性。第二部分恶性高热实验室诊断方法的临床应用目的应用咖啡因-氟烷骨骼肌收缩试验（Caffeine and halothane contracturetest,CHCT）明确恶性高热（Malignant hyperthermia,MH）的诊断。方法总结和介绍4例临床诊断为MH病例的麻醉用药、麻醉方法、临床表现、化验检查、抢救措施及临床转归等临床资料。介绍1例NMS患者可疑同时发生MH,1例嗜铬细胞瘤患者可疑因为服用吗叮啉发生横纹肌溶解的临床表现、化验检查及临床转归等临床资料。进一步应用CHCT进行确诊和鉴别诊断:取患者股四头肌或腹直肌近肌腱部位的肌纤维2～3cm,固定于37℃恒温Krebs液内并持续通入含5%二氧化碳的氧气,连接张力传感器和电刺激仪,给予一定电刺激,测定不同浓度氟烷（和/或咖啡因）下肌肉收缩张力的改变。结果4例临床诊断为MH的患者的咖啡因试验均为阳性,根据北美MH的诊断标准确诊为MH易感者;另2例患者的咖啡因试验和氟烷试验均为阴性,符合非MH易感者的诊断。结论本实验室的CHCT可用于MH的确诊和鉴别诊断。第三部分恶性高热家系的分子遗传学研究目的在咖啡因-氟烷骨骼肌收缩试验（Caffeine and halothane contracturetest,CHCT）确诊恶性高热（Malignant hyperthermia,MH）的基础上,研究中国人MH家系分子遗传学特点。方法在遵守知情同意原则的基础上,一共收集了4个MH家系。分别为家系A、家系B、家系C和家系D,每个家系的先证者均在麻醉中出现典型的MH表现,符合MH的临床诊断标准,并经确诊MH的金标准—CHCT确证为MH患者。分别提取明确诊断为MH的先证者及其他家系成员外周血白细胞的基因组DNA,通过PCR扩增先证者RYR1基因部分外显子并进行直接测序分析。根据基因测序结果,对发现有基因突变的患者,利用FokⅠ限制酶分析验证先证者及其他家系成员基因突变情况。结果家系A中先证者PCR产物测序结果表明:RYR1基因第6724位碱基C突变为T（c.6724C＞T）,所编码2206位氨基酸由苏氨酸变为甲硫氨酸（p.T2206M）,此种突变在白种人已有报道。限制酶分析确认:先证者的4个子女中有2个为该错义突变携带者,为MH易感者。家系B、家系C和家系D中的先证者及其他家系成员的RYR1基因热点区外显子均未发现突变。结论中国人中部分MH易感者携带在白种人MH中频发的RYR1基因突变,但中国人MH家系分子遗传学特点尚需要进一步研究。