论文题目: 幽门螺杆菌抗原UreB的基因工程及免疫原性研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 顾青
导师: 朱睦元
关键词: 幽门螺杆菌,尿素酶亚单位,尿素酶亚单位片段,转基因烟草,转基因水稻,大肠杆菌,乳酸乳球菌,口服免疫
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 幽门螺杆菌（H.pylori）是定植于人的胃上皮的革兰氏阴性致病菌,它是慢性胃炎、胃溃疡的主要致病因子,并且与胃癌和胃淋巴瘤的发生密切相关。在H.pylori各组分抗原中,被证明可诱导产生免疫保护作用的有尿素酶、热休克蛋白、空泡毒素、毒素相关蛋白等。尿素酶不仅是幽门螺杆菌重要的定植因子,它还是一重要毒力因子。尿素酶包括A、B亚单位,分子量分别为29.5kDa、66.0kDa,尿素酶B亚单位是无毒的、具有高免疫原性的保护性侯选抗原。本研究克隆了浙江省幽门螺杆菌的尿素酶B亚单位（UreB）基因,构建了表达载体分别转化烟草、水稻、大肠杆菌和乳酸乳球菌,并作相应的免疫研究。 本研究对H.pylori浙江临床株的UreB基因的克隆和序列分析,证明了UreB基因在不同菌株间的高度的同源性,这为UreB作为保护性抗原的H.pylori疫苗提供可很好的理论支持。本研究选用烟草作为材料来探索植物生产疫苗的可行性。通过构建植物表达载体pBIl21.ureB,以根癌农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum L.）,获得50株转基因植株。经抗生素抗性筛选和PCR、PCR-Southern鉴定,证实35株T0代烟草植株中有ureB基因整合于基因组;RT-PCR和Western blot分别在转录水平和翻译水平显示该外源蛋白已在转基因基因植株中表达。本研究中获得的结果第一次报道H.pylori ureB基因在植物系统中表达,为通过转基因植物来生产UreB重组抗原用作抗H pylori感染的疫苗提供了较好的方法学。 建立了农杆菌介导的利用潮霉素抗性作为筛选标记的水稻转化系统。以水稻成熟胚诱导的愈伤组织为材料,把H pylori的ureB基因连接到CaMV35S启动子后构成pCAMBIA.13011.ureB表达载体,通过根癌农杆菌EHAl05的对水稻胚性愈伤组织进行感染,通过共培养和潮霉素抗性筛选,得到12株转基因再生植株。对所得12株再生苗进行PCR 检测,表明阳性苗比例为75%。PCR—Southern结果进一步证明目的基因确已整合到水稻基因组中。Western-blot结果同样显示UreB蛋白已经水稻中得到表达。本研究结果的获得,将为以后进行转基因后代遗传稳定性和基因表达水平的研究,以及以水稻作为载体进行动物口服免疫试验奠定基础。 本研究为了阐明人胃幽门螺杆菌UreB及UreB部分片段的作为免疫原的特性,用穿梭质粒分别构建了分别构建pAMJ399-ureB、pAMJ399-f、pAMJ399-e、pAMJ399-m,以此分别转化大肠杆菌JM109进行表达研究。经SDS-PAGE和Western blot分析表明,含pAMJ399-ureB、pAMJ399-e的E coli均能表达外源蛋白或肽,其分子量大小分别为66kDa和28kDa,免疫印迹分析证实这些重组
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1．人胃幽门螺杆菌感染的分子机制
1．1 H.pylori基因组概况
1．2 H.pylori感染的分子机制
1．3 H.pylori和宿主免疫应答
1．4 展望
2．植物基因工程疫苗研究进展
2．1 植物疫苗的特点
2．2 生产疫苗的植物表达系统
2．3 基于植物载体的免疫技术
2．4 展望
3．乳酸乳球菌活菌疫苗递送系统
3．1 乳酸乳球菌异源蛋白表达系统
3．2 异源蛋白在乳酸乳球菌的细胞定位
3．3 以乳酸乳球菌作为载体的活菌疫苗
3．4 结论
第二章 H.pylori UreB基因克隆及其在烟草中的表达
1．前言
2．材料和方法
2．1 实验材料
2．2 实验方法
3．结果和分析
3．1 UreB基因克隆及序列测定
3．2 pBI-UreB植物表达载体的构建
3．3 烟草转化植物的获得
3．4 烟草转化植株分子鉴定
4．讨论
4．1 H.pylori ureB ZJC02序列分析
4．2 烟草外源基因表达体系的建立
5．结论
第三章 水稻作为植物可食疫苗载体表达H.pylori UreB基因
1．前言
2．材料和方法
2．1 实验材料
2．2 实验方法
3．结果和分析
3．1 pCAMBIA-ureB植物表达载体的构建
3．2 农杆菌介导的水稻转化体系的建立
3．3 再生植株的分子鉴定
4．讨论
4．1 水稻转化体系的建立
4．2 转基因水稻的UreB递送系统
5．结论
第四章 UreB基因及片段在E.coli中表达及免疫原性
1．前言
2．材料和方法
2．1 质粒、菌株和培养条件
2．2 酶及主要试剂
2．3 质粒构建
2．4 UreB及各片段在E.coli中的表达分析
2．5 重组大肠杆菌表达条件的优化
2．6 小鼠免疫试验
3．结果和分析
3．1 穿梭表达载体的构建
3．2 UreB在大肠杆菌中的表达
3．3 不同培养条件对E.coli表达UreB的影响
3．4 UreB的E片段在大肠杆菌中的表达
3．5 免疫应答抗体的诱导
4．讨论
5．结论
第五章 UreB基因及片段在乳酸乳球菌中表达及口服免疫
1．前言
2．材料和方法
2．1 质粒、菌株和培养条件
2．2 酶及主要试剂
2．3 重组质粒的L.lactis转化
2．4 UreB和E片段的分泌表达分析
2．5 乳酸乳球菌生长状况分析
2．6 小鼠免疫试验
3．结果和分析
3．1 重组乳酸乳球菌的构建
3．2 UreB的E片段在乳酸乳球菌分泌表达
3．3 重组UreB的E片段的免疫印迹分析
3．4 重组乳酸乳球菌生长状况分析
3．5 免疫应答抗体的诱导
4．讨论
5．结论
参考文献(References)
在读博士学位期间的主要业绩
致谢
发布时间: 2005-10-10
参考文献
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