论文摘要
第一部分:大鼠胫骨近端骨骺损伤后骨桥形成的分子机制目的:利用胫骨近端干骺端骨骺损伤的大鼠动物模型,研究骨桥形成的分子病理机制。方法:通过Alcian Blue染色观察损伤模型的建立、损伤愈合过程以及骨桥形成情况。采用Tunel试剂盒进行原位细胞凋亡检测,了解损伤区及周围细胞凋亡情况。采用BrdU抗体检测BrdU标记的增殖细胞,明确损伤区周围软骨细胞增殖活性是否发生改变。利用免疫组织化学方法、原位杂交实验,观察损伤区周围肥大区软骨细胞是否改变,检测损伤区是否有软骨细胞生成,并确定损伤周边软骨细胞是否存活,检测Ihh表达以及Ptch1表达阳性细胞,损伤区是否有其表达,及周围未损伤软骨是否正常表达。结果:发现在骨骺损伤后骨桥形成过程中,在完全损伤区中心没有软骨细胞特异的因子ColⅡ和Col X以及Indian Hedgehog（Ihh）和Ptch1的表达,没有软骨细胞增殖,但是发现完全损伤区和周围正常软骨交届间存在次损伤软骨区,存在软骨细胞凋亡,有Col X的表达,BrdU和Vimentin检测发现在此区和周围正常软骨间由正常肥大区软骨细胞异常增殖、分化而来的成纤维样细胞形成软骨外膜样结构,次损伤区和软骨外膜结构逐渐被骨桥替代,在此过程中软骨外膜样结构存在Col1、Ptch1和Ihh的表达,提示由软骨细胞分泌的促成骨生成有关的生长因子Ihh可能参与骨桥形成过程。结论:提出骨桥形成是由两种成骨机制共同参与的结果,在此过程中损伤中心区域存在膜内化骨机制,边缘区域存在软骨化骨作用机制。第二部分:大鼠胫骨近端骨骺损伤后预防骨桥形成的方法目的:利用胫骨近端干骺端骨骺损伤的大鼠动物模型,通过比较不同方法修复生长板损伤的治疗效果,评价纤维蛋白胶材料应用于微创治疗方法的可行性。方法:利用未成熟大鼠制作胫骨近端骨骺损伤模型。通过组织化学染色观察损伤模型的建立、损伤愈合过程以及骨桥形成情况。28只大鼠单侧胫骨近端骨骺损伤,右侧损伤侧,左侧正常对照侧。另外28只大鼠胫骨近端骨骺双侧损伤,左侧植入脂肪,右侧植入纤维蛋白胶。术后取材先进行显微CT检查,再行组织学检测。比较纤维蛋白胶、脂肪作为填充材料预防治疗大鼠胫骨近端骨骺损伤后骨桥形成的情况,以及大鼠胫骨长度和近端角度的变化。结果:术后16周及24周,纤维蛋白胶和脂肪填充组损伤区域显示低密度影混杂高密度影量,单纯损伤组损伤区域显示明显骨桥。组织学检查显示,纤维蛋白胶和脂肪填充组损伤区域逐渐被纤维组织替代,单纯损伤组损伤区域逐渐被骨桥组织替代。纤维蛋白胶填充治疗组在控制胫骨近端骨骺损伤后的畸形方面不如脂肪填充治疗组,但没有显著差异。在避免损伤区出现不可逆的骨桥方面,与脂肪填充治疗组效果接近（p>0.05）。纤维蛋白胶填充组与单纯损伤组之间存在明显差异（p<0.05）,脂肪填充组与单纯损伤组之间存在非常明显差异（p<0.01）。结论:纤维蛋白胶制作来源广泛,术中应用简便,效果与传统的脂肪填充治疗接近,因而推测可能作为一种新的生物材料引入临床,预防骨骺损伤后的骨桥形成。显微CT可以用于骨骺损伤后骨桥形成的观察研究中。第三部分:VEGF对大鼠胫骨近端骨骺损伤骨桥形成的影响目的:观察VEGF在骨桥形成过程中的作用,研究预防骨桥形成的新型微创方法的理论基础。方法:利用未成熟大鼠制作胫骨近端骨骺损伤模型。32只大鼠单侧胫骨近端骨骺损伤,右侧损伤侧,左侧正常对照侧。20只大鼠胫骨近端骨骺双侧损伤,左侧单纯植入anti-VEGF-Flt。术后取材先进行显微CT检查,再行组织学检测。利用原位杂交实验检测VEGF在损伤区表达情况。通过组织化学染色观察损伤愈合过程以及骨桥形成情况利用显微CT观察anti-VEGF-Flt填充后预防大鼠胫骨近端骨骺损伤后骨桥形成情况,以及大鼠胫骨长度和近端角度的变化。结果:损伤后第10天在损伤区开始出现VEGF表达。单纯注射anti-VEGF-Flt术后16周及24周损伤区域显示低密度影混杂高密度影量增多并出现骨桥。组织学检查显示,anti-VEGF-Flt组逐渐被纤维组织和骨组织共同充填,单纯损伤组损伤区域逐渐被骨桥组织替代。在避免损伤区出现不可逆的骨桥和预防大鼠胫骨骨骺损伤后出现近端畸形方面,anti-VEGF-Flt组在早期有较好抑制效果,后期效果不佳。结论:VEGF信号途径参与骨桥的形成,通过抑制VEGF信号可以在早期抑制骨桥形成,但是后期抑制效果减弱。第四部分:anti-VEGF-Flt复合FS预防大鼠胫骨近端骨骺损伤的骨桥形成目的:利用VEGF本身的特性和纤维蛋白胶的优势结合,开发可注射型修复材料,建立一种微创生物学治疗方法,研究预防骨桥形成的可行性及治疗效果。方法:利用未成熟大鼠制作胫骨近端骨骺损伤模型。20只大鼠单侧胫骨近端骨骺损伤,右侧损伤侧,左侧正常对照侧。20只大鼠胫骨近端骨骺双侧损伤,左侧植入脂肪,右侧植入纤维蛋白胶。20只大鼠胫骨近端骨骺双侧损伤,左侧单纯植入anti-VEGF-Flt,右侧植入复合纤维蛋白胶的anti-VEGF-Flt。术后取材进行显微CT检查。比较复合纤维蛋白胶的anti-VEGF-Flt、单纯anti-VEGF-Flt、纤维蛋白胶、脂肪填充后预防治疗大鼠胫骨近端骨骺损伤后骨桥形成的情况,以及大鼠胫骨长度和近端角度的变化。结果:在预防大鼠胫骨骨骺损伤后出现近端畸形方面,虽然在早期的区别不大,但在后期复合纤维蛋白胶的anti-VEGF-Flt填充组明显优于单纯纤维蛋白胶填充组和单纯anti-VEGF-Flt组,且好于脂肪填充组。在避免损伤区出现不可逆的骨桥方面,复合纤维蛋白胶的anti-VEGF-Flt填充组与脂肪填充治疗组效果无差异（p>0.05）,两者都与单纯损伤组之间存在非常明显差异（p<0.01）。结论:anti-VEGF-Flt复合纤维蛋白胶移植方法具有更为显著的避免早期成角及短缩畸形以及减轻最终畸形的优势,操作简便、止血效果明确,可以作为一种新型生物学治疗方法应用于预防骨骺损伤后预防骨桥形成、骨骺早闭的临床治疗中。