论文摘要
目的:探讨环氧合酶2（Cyclooxygenase 2,COX-2）对于香烟提取物（Cigarette Smoking Extract,CSE）所诱导的内皮细胞凋亡的影响。方法:体外培养人血管内皮细胞株（ECV-304）,取指数生长期细胞用于实验。一支去过滤嘴燃烧的香烟由负压吸引驱动装置连续抽吸,吸入烟雾,经三通管的一个出口入无血清1640培养液中制成悬液,过滤除菌,并稀释成含不同浓度CSE的1640培养基,1 h内用于实验。整个实验分为三个部分:1.内皮细胞培养,按照CSE的干预浓度不同,将实验分成四组,即对照组、0.5%CSE干预组、1%CSE干预组、5%CSE干预组。各组细胞培养12h后,采用Hoechst染色法和流式细胞术检测细胞的凋亡情况,免疫细胞化学和Western Blot法检测COX-2的蛋白表达。2.根据上一步实验的结果,选取5%CSE为干预点,分别干预血管内皮细胞0小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时后,采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况,Western Blot法检测COX-2的蛋白表达。3.综合前两步实验的结果,用5%CSE和不同浓度的选择性COX-2抑制剂塞莱西布（celecoxib）,共同干预内皮细胞。根据塞莱西布的干预浓度不同,将实验分为七组,即对照组（0%CSE）、5%CSE干预组、5%CSE+2.5μM/L塞莱西布干预组、5%CSE+5μM/L塞莱西布干预组、5%CSE+10μM/L塞莱西布干预组、5%CSE+20μM/L塞莱西布干预组、5%CSE+50μM/L塞莱西布干预组。各组干预9小时后,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western Blot法检测COX-2的蛋白表达。结果:（1）不同浓度的CSE分别干预内皮细胞12小时后,Hoechst染色检测细胞凋亡结果为,对照组（6.5±0.54%）,干预组结果分别为（7.6±0.41%）、（13.5±1.78%）、（32.3±3.22%）,0.5%CSE干预组与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）,余各组间均存在统计学差异（P值均＜0.05）;流式细胞术测得细胞凋亡率为,对照组（1.61±0.24%）,干预组结果分别为（2.01±0.36%）、（2.31±0.26%）、（5.40±0.39%）,各组间比较,均存在统计学差异（P值均＜0.05）;Western Blot检测COX-2表达结果显示,随着CSE干预浓度的升高,COX-2的表达逐渐增强,5%CSE干预后COX-2蛋白的表达最高。（2）5%CSE作用于内皮细胞不同时间后,流式细胞术测得各组细胞凋亡率为,对照组（1.73±0.16%）、各干预组分别为（2.69±0.28%）、（2.86±0.15%）、（3.66±0.40%）、（5.39±0.57%）、（8.87±0.41%）。3小时组和6小时组比较,结果无统计学差异（P＞0.05）,余各组间比较均存在统计学差异（P值均＜0.05）。Western Blot检测COX-2表达结果显示,随着5%CSE干预时间的延长,COX-2的表达逐渐增强。干预3小时的时侯COX-2蛋白的表达开始增加,9小时达峰,12小时开始逐渐减弱,24小时时明显消失。（3）5%CSE与不同浓度的选择性COX-2抑制剂塞莱西布共同作用于内皮细胞9小时后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率结果显示对照组为（1.78+0.21%）,各干预组分别为（3.90±0.27%）、（3.56±0.39%）、（3.13±0.38%）、（2.92±0.21%）、（4.69±0.50%）、（32.60±5.51%）。其中5%CSE+50μM/L塞莱西布干预组与其余各组比较,内皮细胞凋亡率显著增高,结果存在统计学差异（P值均＜0.05）,余各组间比较均无统计学差异（P值均＞0.05）。Western Blot检测COX-2表达结果显示,随着塞莱西布干预浓度的升高,COX-2的表达逐渐减弱。结论:（1）CSE可以诱导内皮细胞的凋亡甚至死亡,且存在浓度依赖性和时间依赖性。（2）CSE能够诱导内皮细胞分泌COX-2蛋白,而且存在浓度依赖性和时间依赖性。（3）选择性的COX-2抑制剂塞莱西布,可以抑制内皮细胞COX-2蛋白的表达,并呈现浓度依赖性,低浓度的塞莱西布不足以诱导内皮细胞的凋亡,高浓度则可以促进内皮细胞的凋亡,甚至诱发其死亡。（4）COX-2有助于缓解CSE诱导的内皮细胞的凋亡,在维持内皮细胞的存活方面起着一定的作用。
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