鸡CⅡ的分离提取、生物学特性分析及其口服耐受对类风湿性关节炎干预的研究

论文摘要

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以慢性滑膜炎症、关节软骨侵蚀为特征的自身免疫性疾病,发病机制未明。Ⅱ型胶原蛋白（typeⅡcollagen, CⅡ）是软骨基质的主要有机成分,由3条相同的α1（Ⅱ）链组成。近年来研究表明,类风湿性关节炎的发病与CⅡ诱导的自身免疫应答有关,在10%-30%的RA患者血清和关节滑液可检测到抗天然和变性CⅡ抗体,用CⅡ免疫某些动物可诱导出实验性关节炎,口服CⅡ诱导免疫耐受对类风湿性关节炎有显著的疗效。但是研究结果差别很大,在抗CⅡ自身抗体的产生和诱导免疫耐受的机制方面研究进展缓慢,极大地限制了CⅡ的临床实际应用。主要影响因素包括：（1）CⅡ的来源和提取方法；（2）CⅡ抗体检测条件；（3）CⅡ的生物学特性、消化酶对其的作用；（4）口服CⅡ的剂量、剂型和机体胃肠道黏膜的免疫状态等。在本研究中,我们通过选择分离条件,建立了从鸡胸箭突软骨中提取和纯化CⅡ的可靠方法,对CⅡ的生物学特性进行了系统分析；优化实验条件,建立了血清抗CⅡ抗体的ELISA检测法,并探讨其在类风湿性关节炎的应用价值；体外研究各种消化酶对CⅡ的水解片段,体内经口服观察机体特异性IgG、IgA、IgM抗体的产生水平和对派氏集合淋巴结细胞因子表达的影响,探讨口服CⅡ诱导免疫耐受的可能性和对类风湿性关节炎干预的可能机制。第一部分Ⅱ型胶原蛋白的提取和纯化目的：优化实验条件,建立提取和纯化Ⅱ型胶原蛋白的可靠方法。方法：选择鸡胸箭突软骨为提取原料,用盐酸胍去除蛋白多糖,对胃蛋白酶的消化方式、氯化钠盐析浓度、DEAE阴离子树脂种类进行研究,采用SDS-PAGE对CⅡ进行鉴定。结果：鸡胸箭突前处理方便,其软骨匀浆液主要含有CⅡ在内的4种蛋白质。4 mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖；采用分步消化方式、控制反应温度在4℃、消化后的胶原蛋白溶液迅速调节到pH7.5等措施能获得满意的限制性酶解结果；氯化钠盐析浓度为2.4mol/L时最佳。SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的CⅡ与Sigma公司的产品一致,亚基分子量约为120kD。结论：改进后的方法具有材料广泛、实验条件简便、结果可靠等优点,适用于科研、临床等各种规模CⅡ的提取。第二部分Ⅱ型胶原蛋白的生物学特性研究目的：研究CⅡ的物理化学特性、抗体产生规律和免疫反应性。方法：用光谱法测定CⅡ吸收峰和等电点、HPLC法检测CⅡ氨基酸组成、乌氏黏度计测定不同条件下CⅡ溶液的增比黏度。SDS-PAGE法测定分子量,结合免疫印迹法分析CⅡ和热变性CⅡ（denatured typeⅡcollage, D-CⅡ）的免疫反应性。用CⅡ免疫新西兰白兔,每隔10天收集血清,以改良间接ELISA法检测抗CⅡ抗体效价。结果：SDS-PAGE电泳显示CⅡ有α、β和γ三条区带,都能与抗CⅡ抗体发生特异性反应,α亚基分子量约120kD；D-CⅡ含有10多条免疫印迹反应呈阳性的片段。CⅡ溶液的最大吸收峰为230nm,等电点pH值约6.25。氨基酸组成中,甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量高,芳香族氨基酸低。CⅡ溶液的增比黏度随浓度的增加而增加,在25～45℃范围内随着温度的升高逐渐下降。Ⅱ型胶原蛋白免疫新西兰白兔后,经ELISA检测,在免疫的第10天抗体效价达1：3200,第20天升至1：204800；加强免疫后,第30天和第40天抗体效价分别达到1：409600和1：819200。结论：Ⅱ型胶原蛋白具有独特的理化性质,因富含脯氨酸故具有较强的免疫原性,免疫新西兰白兔后获得高效价的CⅡ血清。第三部分血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用目的：建立血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的ELISA检测法,探讨其在类风湿性关节炎诊断和治疗方面的应用价值。方法：以上述实验提取的鸡Ⅱ型胶原蛋白作为包被抗原,优化实验条件,建立抗Ⅱ型胶原蛋白抗体间接ELISA法。对289例RA病人和54例健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体进行检测。结果：Ⅱ型胶原蛋白抗体ELISA检测法的条件为：先用0.05 mol/L醋酸将CⅡ配成0.5 g/L储存液,再用PH7.60.05 mol/L磷酸盐缓冲液将CⅡ配成20μg/ml的包被液,4℃12 h进行包被,继以10%羊血清、37℃2 h为封闭条件；用含10%羊血清的缓冲液分别将血清作1：50稀释、酶标抗体作1：2000稀释；采用双波长450nm/630 nm进行测定。采用建立的方法,发现RA患者和健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体阳性率分别为19.38%和1.85%,两组有明显的统计学差异（P<0.01）。结论：CⅡ可以作为血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体ELISA法的包被抗原；用含10%羊血清的缓冲液对酶标反应板进行封闭和对血清标本、酶标抗体进行稀释,可以有效地阻止非特异性吸附,提高结果的重复性和特异性。抗Ⅱ型胶原蛋白抗体可作为判断RA患者病情的一个辅助诊断指标。第四部分消化酶对Ⅱ型胶原蛋白作用的体内外研究目的：体外观察消化酶对天然Ⅱ型胶原蛋白（native typeⅡcollage,N-CⅡ）和变性Ⅱ型胶原蛋白（D-CⅡ）的酶解作用；小鼠和大鼠胃肠道给予CⅡ探讨口服Ⅱ型胶原蛋白对类风湿性关节炎可能的干预机制。方法：在体外将胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶分别作用于N-CⅡ和D-CⅡ,采用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法分析酶解产物。将N-CⅡ和D-CⅡ注入鼠胃和十二指肠内,在不同时间收集胃和肠内容物,进行SDS-PAGE电泳分析。结果：CⅡ在胃、肠道能处于溶解状态。在体外,N-CⅡ在胃蛋白酶和糜蛋白酶作用下电泳和免疫印迹图谱无变化,而被胰蛋白酶作用后出现10条免疫印迹为阳性的条带；D-CⅡ易被上述消化酶分解。N-CⅡ不被胃内环境水解,可被肠道消化酶缓慢降解；D-CⅡ可被胃、肠道消化酶迅速分解。结论：N-CⅡ可被胰蛋白酶水解产生多条活性片段,但对胃内环境、胃蛋白酶和糜蛋白酶具有抵抗力；D-CⅡ易被胃、肠道消化酶水解。结果提示口服CⅡ诱导免疫耐受、治疗类风湿性关节炎可能与CⅡ特性和胰蛋白酶对其的作用有关。第五部分口服Ⅱ型胶原蛋白对血清抗体和派氏集合淋巴结细胞因子表达的影响目的：探讨口服Ⅱ型胶原蛋白对派[伊尔]氏集合淋巴结（PP结）的形态学、细胞因子表达水平和血清特异性IgG、IgA、IgM含量的影响。方法：连续10d给小鼠口服不同剂量的CⅡ,第11天和第21天用佐剂或CⅡ进行免疫,分别于第11天、第21天和第31天采集血液和PP结。PP结经HE染色后,镜下观察其增生的情况。用荧光实时定量RT-PCR法,检测PP结中IL-17、TNF-α、IFN-γ和TGF-β1 mRNA的水平。采用ELISA法检测血清抗CⅡIgG、IgA、IgM的水平。结果：口服CⅡ10d后,PP结增生活跃,高剂量组可见清晰的帽状结构；血清中出现IgA,未见IgG和IgM水平增加；IL-17、TNF-α、IFN-γmRNA的表达受到抑制。以CⅡ初次免疫后,实验组IgA、IgM、IL-17的水平均低于对照组（p<0.05或p<0.01）,TGF-β1的水平显著增加（p<0.05）。以CⅡ加强免疫后,高剂量组IgA的水平显著增加（p<0.05）,实验组IgM的水平仍受到抑制（p<0.05或p<0.01）,TGF-β1的水平高于对照组（p<0.05）。以佐剂免疫时PP结中细胞因子的表达与CⅡ免疫时相似,未见血清抗CⅡIgG、IgA、IgM水平的变化。结论：口服CⅡ能使血清中产生特异性IgA,抑制PP结IL-17、TNF-α、IFN-γ的基因表达,对CⅡ免疫后IgA、IgM的产生和IL-17 mRNA的表达具有一定的抑制作用。血清特异性抗体的水平和细胞因子表达的变化的结果表明,口服CⅡ有助于诱导免疫耐受并干预类风湿性关节炎的发生发展,有着潜在的类风湿性关节炎防治作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 胶原
• 1.2.1 胶原的概念
• 1.2.2 胶原和胶原蛋白链的命名
• 1.2.3 胶原的分类及组织分布
• 1.2.4 胶原蛋白的氨基酸组成和结构特征
• 1.2.5 胶原蛋白的合成和分泌
• 1.2.6 胶原蛋白的物理性质
• 1.3 Ⅱ型胶原和Ⅱ型胶原蛋白
• 1.3.1 Ⅱ型胶原的分布
• 1.3.2 Ⅱ型胶原的基因组成和多肽结构
• 1.3.3 Ⅱ型胶原蛋白的提取
• 1.4 类风湿性关节炎与Th1/Th2细胞平衡
• 1.4.1 类风湿性关节炎的诊断标准
• 1.4.2 类风湿性关节炎与Th1/Th2细胞平衡
• 1.4.3 类风湿·性关节炎治疗中细胞因子与信号转导途径的联系
• 1.5 Ⅱ型胶原蛋白在类风湿关节炎发病机制和诊断治疗中的应用
• 1.5.1 Ⅱ型胶原蛋白诱导的关节炎动物模型研究
• 1.5.2 Ⅱ型胶原蛋白用于血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的检测
• 1.5.3 Ⅱ型胶原蛋白防治关节炎的研究
• 1.6 Ⅱ型胶原蛋白研究中的存在问题
• 1.6.1 Ⅱ型胶原蛋白的提取和生物学特性
• 1.6.2 血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的检测
• 1.6.3 口服CⅡ对RA的防治机制与效果
• 1.7 本课题的立题意义
• 第二章 Ⅱ型胶原蛋白的提取和纯化
• 2.1 实验仪器和材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 主要材料
• 2.1.3 主要溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 阴离子交换树脂的处理
• 2.2.2 Ⅱ型胶原蛋白的提取与纯化
• 2.2.3 SDS-PAGE电泳检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 Ⅱ型胶原蛋白的提取
• 2.3.2 Ⅱ型胶原蛋白的纯化
• 2.3.3 Ⅱ型胶原蛋白亚基分子量的测定
• 2.4 讨论
• 第三章 Ⅱ型胶原蛋白的生物学特性分析
• 3.1 实验仪器和材料
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 主要材料
• 3.1.3 免疫用动物
• 3.1.4 主要溶液配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 Ⅱ型胶原蛋白的提取和变性Ⅱ型胶原蛋白的制备
• 3.2.2 羊血清的采集与处理
• 3.2.3 兔抗Ⅱ型胶原蛋白抗血清的制备与标本采集
• 3.2.4 血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体及其效价的检测
• 3.2.5 SDS-PAGE和免疫印迹检测
• 3.2.6 氨基酸成分分析
• 3.2.7 吸收光谱测定
• 3.2.8 等电点的测定
• 3.2.9 增比黏度测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 CⅡ的提取与纯化
• 3.3.2 兔抗鸡Ⅱ型胶原蛋白抗体产生情况
• 3.3.3 CⅡ和D-CⅡ免疫印迹结果
• 3.3.4 CⅡ氨基酸成分分析
• 3.3.5 CⅡ吸收光谱分析
• 3.3.6 CⅡ等电点测定
• 3.3.7 CⅡ溶液的增比黏度
• 3.4 讨论
• 第四章 血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用
• 4.1 实验仪器和材料
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 主要材料
• 4.1.3 主要溶液配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 CⅡ的提取与纯化
• 4.2.2 羊血清的采集与处理
• 4.2.3 标本来源
• 4.2.4 血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与条件优化
• 4.2.5 结果统计分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 ELISA法检测血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的最适条件
• 4.3.2 RA患者及健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测
• 4.4 讨论
• 第五章 消化酶对Ⅱ型胶原蛋白作用的体内外研究
• 5.1 实验仪器和材料
• 5.1.1 实验仪器
• 5.1.2 主要材料
• 5.1.3 主要溶液配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 天然Ⅱ型胶原蛋白和变性Ⅱ型胶原蛋白的制备
• 5.2.2 溶液酸碱度与Ⅱ型胶原蛋白溶解性的测定
• 5.2.3 兔抗鸡Ⅱ型胶原蛋白抗血清的制备
• 5.2.4 在体外消化酶对Ⅱ型胶原蛋白的作用条件
• 5.2.5 胃肠道对Ⅱ型胶原蛋白和变性Ⅱ型胶原蛋白的作用
• 5.2.6 SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 N-CⅡ和D-CⅡ免疫印迹分析
• 5.3.2 溶液pH与Ⅱ型胶原蛋白溶解性
• 5.3.3 在体外消化酶对Ⅱ型胶原蛋白的作用
• 5.3.4 在体内胃、肠道消化酶对Ⅱ型胶原蛋白的作用
• 5.4 讨论
• 第六章 口服Ⅱ型胶原蛋白对血清抗体和派氏集合淋巴结
• 6.1 实验仪器和材料
• 6.1.1 实验仪器
• 6.1.2 主要材料
• 6.1.3 主要溶液配制
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 Ⅱ型胶原蛋白的制备
• 6.2.2 实验动物分组与处理
• 6.2.3 羊血清的采集与处理
• 6.2.4 血清特异性抗CⅡ抗体的检测
• 6.2.5 PP结中细胞因子基因表达的荧光实时定量RT-PCR检测
• 6.2.6 统计学分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 口服CⅡ后PP结的形态变化
• 6.3.2 口服CⅡ对血清特异性抗CⅡ抗体水平的影响
• 6.3.3 口服CⅡ和CⅡ、佐剂免疫对PP结中细胞因子基因表达的作用
• 6.4 讨论
• 第七章 主要结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 读博期间发表论文、参加课题