猪细小病毒PCR诊断方法建立及标准制订

论文摘要

猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一,其特征是孕前期受到感染,经胎盘使胚胎受到侵袭,引起初产母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等,同时还可以引起仔猪的皮炎和腹泻,其它类型的猪感染后无明显临床特征。猪细小病毒病存在于世界各地并在大多数猪场流行,严重影响着养猪业的发展,因此本病一直是猪病研究的热点之一,PPV又常同猪伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒、圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等混合感染而加重了其危害。近年来,PPV感染呈扩大上升的趋势,给全球养猪业带来巨大的经济损失。所以,加强对PPV的检测、监测及预防十分紧迫。目前,猪细小病毒病诊断方法主要有:病毒分离、血凝抑制试验和乳胶凝集试验等检测方法,其中血凝抑制实验相对简便,但由于要制备豚鼠红细胞以及被检血清必须经高岭土或其它方法处理而显得麻烦;乳胶凝集试验的灵敏度不高,尤其是对隐性感染动物往往漏检;病毒分离和鉴定结果准确可靠,但是该方法费时费力,并且需要一定的技术条件和设备;聚合酶链式反应（PCR）及荧光定量PCR诊断具有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点成为诊断猪细小病毒的研究热点。为此,我们进行了以下研究:（一）根据已报道的PPV基因组序列,设计并合成了1对寡核苷酸引物,通过优化PCR的条件,成功地从PPV感染的细胞中扩增出322bp片段,回收PCR产物测序,并用BstⅩⅠ进行酶切,得到209 bp、113bp的两条带,与预期的结果相符合,证实了该扩增片段的特异性,并对PRV DNA、PCV-2 DNA和正常PK-15细胞基因组DNA的PCR扩增均为阴性,证明了PCR检测方法的特异性,PCR检测模板DNA的最小量为10fg(约10-4个TCID50的病毒含量)。（二）设计并合成引物和相对应的探针,从PPV感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T Easy载体连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,证实目的片段已经成功克隆。将系列梯度稀释的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系。动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,该标准曲线的灵敏度为90个拷贝(约10-6个TCID50的病毒含量)。荧光PCR方法的建立,为猪细小病毒的早期诊断、定量分析评价猪细小病毒感染程度奠定了基础。（三）在建立的PPV和猪伪狂犬病毒（PRV）的单相PCR基础上,通过对扩增条件的筛选,最终成功地建立了PPV和PRV的复合PCR诊断方法,即利用一次PCR反应,可同时扩增PPV的751 bp和PRV的355 bp特异性片段,而扩增猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）及相应的培养细胞（PK-15）核酸结果均为阴性,对PPV和PRV细胞培养物模板DNA的最低检出量分别为100pg(约1个TCID50的病毒含量)和10pg(约1个TCID50的病毒含量)。该方法适合对PPV和PRV的联合检测和鉴别诊断。

论文目录

• 中文摘要
• 文献综述
• 引言
• 试验一 应用PCR方法检测猪细小病毒的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 试验二 实时荧光定量PCR检测猪细小病毒的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 试验三 复合PCR检测猪细小病毒和猪伪狂犬病毒的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 猪细小病毒PCR诊断标准（草案）
• 猪细小病毒与猪伪狂犬病毒复合PCR诊断标准（草案）
• 参考文献
• 英文摘要
• 致谢