松墨天牛引诱剂和松材线虫分子检测技术研究

论文摘要

松材线虫病是当前严重危害我国和世界林业安全的松树毁灭性病害。因其病原物松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）危害严重且防治困难而被世界上许多国家列入检疫对象。松材线虫主要通过媒介昆虫松墨天牛（Monochamus alternatus）在松树上取食和产卵时进行自然传播。松墨天牛既是松材线虫病的媒介昆虫,又是我国松树的重要蛀干害虫。控制松墨天牛的种群不但可以减轻对松树的直接危害,而且可以阻止松材线虫病的的传播和扩散。本论文在导师的指导下,通过全面查阅分析松材线虫病研究文献资料,确定松墨天牛补充营养阶段引诱与松材线虫快速检测为论文的主要内容开展了研究工作。利用固相微萃取法和水蒸气蒸馏法分别提取了五种寄主植物的枝条和针叶的挥发物,结合GC-MS技术分析确定了挥发物的主要组分,并比较分析了主要挥发性物质的组成比例和含量在树种间、相同树种健康和受害木之间和枝条和针叶之间的差异。最后确定了对媒介昆虫松墨天牛引诱有效的植物挥发物的主要成分;利用触角电位法开展了松墨天牛对信息化合物的的EAG和行为反应研究。根据GC-MS的分析结果,筛选出挥发物中十种主要组分进行生物测定,结果表明,单萜引起的电位值最大,芳香族物质次之,倍半萜最小。将单体化合物按照一定比例复配后,EAG反应值明显大于单体化合物的反应值,复配的化合物之间引起的EAG反应存在差异。嗅觉仪实验中,松墨天牛对复配的化合物引起的趋向反应有较明显的差异。对化合物剂量反应显示,随着浓度的增加,无论是电生理还是行为反应均增强,但雌雄虫对同一化合物的反应阈值是有差异的。同时开展了松墨天牛对感病寄主与健康寄主提取物的EAG和行为反应研究,生物测定结果表明,交配前,健康木比松材线虫危害木能够引起未交配天牛更加明显的触角电位反应;在嗅觉仪中对健康木的表现为正趋性,对松材线虫为害的黑松均呈负趋性。而交配后,雌雄天牛对松材线虫危害木的EAG反应值显著大于对健康木的;在嗅觉仪中对健康木的表现为正趋性,成虫对黑松健康木均呈负趋性,而对松材线虫危害木呈正趋性。在健康木挥发物的日龄变化的反应中,羽化后的成虫随着日龄的增加,EAG反应值和趋性反应都逐渐提高,15日龄后,EAG反应和行为反应的变化均无规律。在上述研究的基础上开展了引诱剂的筛选及其引诱作用的研究,初步开发研制了引诱效果良好的松墨天牛引诱剂。通过开展松材线虫特异性引物PCR检测技术法与ITS-PCR-PFLP检测技术比较研究,根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物与探针TaqMan-MGB;结合利用实时荧光PCR快速检测技术,成功研制了松材线虫实时荧光PCR快速检测试剂盒。利用该试剂盒F/R检测单条线虫,其结果显示,来自日本、美国、以及我国安徽、浙江、广东、江苏等病区的7个松材线虫株系均表现有荧光信号,且CT值在18-25之间。而来自韩国、中国台湾、湖北、江苏的4个拟松材线虫株系、美国、中国山东的大核滑刃线虫、中国四川的霍夫曼尼伞滑刃线虫、江苏的长尾属线虫等8个线虫株系以及1个无模板的对照（CK）均无阳性扩增信号,检测不到CT值。表明该探针与引物组合具有较强的特异性。另外将已知浓度的松材线虫DNA样品稀释为10、1、0.1、0.01 ng/μL以及1 pg/μL等5个浓度梯度,检测其扩增灵敏度,结果显示样品模板DNA含量大于1 pg/μL时,该探针与其配套引物就可检测到松材线虫的扩增信号。在10μL的反应体系中,该探针及其引物对可检测到0.5 pg的松材线虫DNA浓度,其灵敏性非常高。同时利用来自不同地区的80个松材线虫样本,8个拟松材线虫样本,2个霍夫曼尼伞滑刃线虫样本,3个大核滑刃线虫样本, 2个长尾属线虫样本,1个无DNA模板对照样本对研究设计的TaqMan-MGB探针进行检测验证,结果显示,所有80个松材线虫样本均有较强的阳性扩增信号,其CT值为13-24。其它拟松材线虫、伞滑刃线虫、大核滑刃线虫和长尾属线虫样本,1个无DNA模板对照均没有荧光信号,无CT值。本研究设计的TaqMan-MGB探针与引物组合F/R具有广泛的应用价值。本套探针和引物设计已被中华人民共和国国家知识产权局授予发明专利权。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 引言
• 上篇 文献综述
• 第一章 松材线虫病的发生与研究概况
• 1 松材线虫病的发生与危害
• 1.1 松材线虫病在国外的发生与危害情况
• 1.2 松材线虫病在中国的发生与危害情况
• 2 松材线虫病的病因
• 2.1 松材线虫是松材线虫病的唯一病原
• 2.2 松材线虫病是由松材线虫、真菌和细菌共同作用导致的
• 3 松材线虫致病机理
• 3.1 酶学说
• 3.2 毒素学说
• 3.3 空洞化学说
• 3.4 伴生微生物学说
• 3.5 松材线虫食道腺分泌物致病理论
• 3.6 松树感染松材线虫后理化特征变化的研究
• 3.6.1 松材线虫在抗性黑松体内移动及寄主水势变化
• 3.6.2 松材线虫侵染对松树苯丙氨酸解氨酶及酚类物质具有重要的影响
• 3.6.3 松材线虫侵染对过氧化物酶和多酚氧化酶的影响
• 3.6.4 松材线虫入侵后对马尾松根际土壤性质的影响
• 4、松材线虫病媒介昆虫
• 4.1 松材线虫病的媒介昆虫种类
• 4.2 松墨天牛概述
• 4.3 松材线虫与松墨天牛的生物学关系
• 4.4 松材线虫的生活史与媒介天牛的生活史相偶联
• 4.5 松材线虫对寄主和媒介昆虫化学信息信号的识别与利用
• 5 松材线虫病防治技术研究概况
• 5.1 针对松材线虫的防治技术
• 5.2 针对松墨天牛的防治技术
• 第二章 松墨天牛引诱剂研究进展
• 1 寄主中引诱天牛成虫的物质
• 2 松墨天牛引诱剂使用概况
• 第三章 松材线虫病检测技术研究进展
• 1 针叶树体内伞滑刃线虫的种类
• 2 松材线虫病检测鉴定方法研究进展
• 2.1 形态学鉴定
• 2.2 流胶检测法
• 2.3 化学鉴定法
• 2.4 生物化学鉴定法
• 3 分子检测技术
• 3.1 DNA 探针技术
• 3.2 RAPD（随机扩增多态性）技术
• 3.3 PCR-RFLP 技术
• 3.4 PCR-SSCP 技术
• 3.5 特异引物PCR 技术
• 3.6 实时定量PCR 技术
• 下篇 研究内容
• 第四章 松墨天牛人工实验种群建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同培养配方对松墨天牛发育历期的影响
• 2.2 不同培养配方对松墨天牛生活力的影响
• 3 结论与讨论
• 第五章 寄主松树挥发性物质的分析测定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 仪器及分析条件
• 2 结果与分析
• 2.1 感病寄主与健康寄主挥发性物质的的分析比较
• 2.2 四种针叶树挥发性物质的的分析比较
• 2.3 结论与讨论
• 第六章 松墨天牛对信息化合物的触角电位（EAG）反应
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 触角电位（EAG）实验方法
• 1.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 松墨天牛对健康与被害寄主挥发物的EAG 反应
• 2.2 不同日龄松墨天牛成虫对黑松挥发物的EAG 反应
• 2.3 松墨天牛对单一化合物的EAG 反应比较
• 2.4 松墨天牛对多组分化合物的EAG 反应比较
• 2.5 松墨天牛对复配化合物剂量的EAG 反应
• 3 结论与讨论
• 第七章 松墨天牛对几种信息化合物的行为反应
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 供试昆虫：同第六章
• 1.1.2 健康与被害寄主挥发物提取：见第五章1.2.1
• 1.1.3 标准化合物：同第六章。实验前应用原液按照一定比例配制成样品
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 松墨天牛成虫对黑松挥发物的嗅觉反应
• 2.2 不同日龄松墨天牛对黑松健康木挥发物的嗅觉反应
• 2.3 松墨天牛对几种信息化合物的行为反应
• 2.4 松墨天牛对化合物的剂量反应
• 3 结论与讨论
• 第八章 松墨天牛引诱剂的筛选及其引诱作用的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验地点
• 1.2 试验材料
• 1.3 诱捕器
• 1.4 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 种群数量变化规律
• 2.2 不同引诱剂的引诱效果
• 2.3 雌、雄虫的变化规律
• 2.4 不同诱捕器的引诱效果比较
• 2.5 不同释放速率的引诱效果比较
• 2.6 不同α-蒎烯异构体配比的引诱效果比较
• 3 结论与讨论
• 第九章 松材线虫两种常规分子检测技术的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 特异性引物PCR 法
• 2.2 ITS-PCR-RFLP 法
• 3. 结论与讨论
• 第十章 松材线虫实时荧光快速检测技术研究
• 1 材料和方法
• 1.1 供试线虫
• 1.2 仪器试剂
• 1.3 研究方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 TaqMan－MGB 探针特异性检测
• 2.2 TaqMan－MGB 探针检测灵敏度检测
• 2.3 不同种源松材线虫快速检测技术验证
• 3. 结论与讨论
• 第十一章 结论与探讨
• 1 松墨天牛引诱剂研究
• 1.1 比较分析了固相微萃取法和水蒸气蒸馏法提取的四种寄主植物的枝条和针叶的挥发物组分
• 1.2 比较分析了松材线虫病危害与健康的的枝条和针叶的挥发物化学组分
• 1.3 松墨天牛对感病寄主与健康寄主提取物的EAG 和行为反应
• 1.4 松墨天牛对信息化合物的的EAG 和行为反应
• 1.5 引诱剂的筛选及其引诱作用的研究
• 2 松材线虫分子检测技术研究
• 2.1 松材线虫特异性引物PCR 检测技术法与ITS-PCR-RFLP 检测技术比较
• 2.2 以rDNA-ITS 区域序列为靶标，设计了用于松材线虫的快速检测的TaqMan－MGB 探针
• 2.2.1 本研究设计的TaqMan－MGB 探针具有较强的特异性
• 2.2.2 本研究设计的TaqMan－MGB 探针检测灵敏度良好
• 2.2.3 利用本研究设计的TaqMan－MGB 探针可用于检测不同种源松材线虫
• 参考文献
• 本课题发表的相关论文
• 详细摘要