郑州市HIV感染者耐药突变研究及HIVP24抗原检测方法的建立

论文摘要

艾滋病全称为获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immuno deficiencySyndrome，AIDS），是由于人体感染人类免疫缺陷病毒（Human Immuno deficencyVirus，简称艾滋病病毒，HIV）而发生的一种传染病。目前，当今世界还没有研制出有效地预防艾滋病的疫苗，在这种形式下，治疗艾滋病的手段为主要为高效抗反转录病毒治疗（Highly Active Anti-RetroviralTherapy，HAART）；HAART能够最大限度的抑制病毒在细胞内的复制，从而延长艾滋病患者的寿命，减少病死率。目前艾滋病抗病毒药物主要有三类:核苷类反转录酶抑制剂（nucleosidereverse transcriptase inhibitor，NRTI）非核苷类反转酶抑制剂（non-nucleosidereverse transcriptase inhibitor，NNRTI）、蛋白酶抑制剂protease inhibitor，PI)。而耐药病毒株的出现导致病毒对药物不敏感或敏感性下降是抗病毒治疗失败的主要因素之一。因此，对接受HAART治疗的病人进行耐药突变的检测，以了解当前耐药突变的构成，是制定合理用药方案，提高HIV感染者生活质量、降低死亡率的有效手段。本实验拟通过对2011年河南省郑州市150例HIV感染者的基因型分析，探索HIV耐药毒株的发生情况及影响因素。实验采集2011年河南省某市150份HIV/AIDS患者血清，提取RNA，逆转录及巢式PCR扩增HIV-1pol基因区，所得序列构建系统进化树分析亚型；并利用Stanford HIV Drug Resistance Database分析HIV基因耐药相关突变和耐药情况。结果显示：150份样本中34份测序阳性，其中未接受抗病毒治疗样本9份，接受抗病毒治疗样本25份；B亚型占94.1%。测序阳性样本的基因突变率为58.8%，其中未接受抗病毒治疗的突变率为22.2%，接受抗病毒治疗的突变率为72%。从而得出结论：接受抗病毒治疗的耐药样本中出现了对反转录酶抑制剂不同程度的耐药及多药耐药，说明仍需加强耐药监测及管理，尽量减少耐药株的产生，并根据耐药检测结果及时调整治疗方案。与此同时，本课题还利用已有的重组P24抗原，结合指数富集配体的系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）方法进行P24抗原的检测方法探究。SELEX是一项将文库技术（library）与筛选技术相结合的新技术，可以从构建的随机核酸文库中筛选出与靶分子特异结合的核酸配基。实验分别通过PharmaLink蛋白柱以及硝酸纤维膜固定纯化后的P24抗原，之后将一段随机合成的72bp核酸序列与P24抗原相互作用，先洗脱未结合的核酸序列，再洗脱、收集与P24抗原相结合的核酸序列，并以之为模板进行PCR扩增，得到的扩增产物即为第一轮SELEX法筛选P24抗原配基的产物。之后将第一轮产物于95℃解链，迅速冰浴后，将单链产物与P24抗原相互作用，进行第二轮SELEX筛选。经过几轮筛选后，直至得到与P24抗原高特异性结合的核苷酸配基。本研究通过简化了操作程序，建立了一种改进SELEX技术，使快速筛选蛋白配基成为可能。

论文目录

• 主要英文缩写词
• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 HIV 概述
• 1.1.1 艾滋病的历史和影响
• 1.1.2 艾滋分类法和流行病学
• 1.1.3 艾滋病感染三阶段
• 1.1.4 病毒结构及形态
• 1.1.5 HIV 基因组
• 1.2 HIV 的抗逆转录病毒治疗与耐药
• 1.2.1 抗逆转录病毒治疗药物分类
• 1.2.2 耐药性突变
• 1.2.3 耐药突变的主要检测方法
• 1.3 HIV-1P24 蛋白的新型检测 SELEX 技术
• 1.3.1 HIV-1P24 概述
• 1.3.2 HIV 新型检测技术 SELEX 概述
• 1.4 本实验主要研究内容
• 1.5 本章小结
• 第2章 郑州市 HIV 感染者基因型耐药横断面调查
• 2.1 研究对象和方法
• 2.1.1 研究对象
• 2.1.2 研究方法
• 2.2 实验仪器，试剂和耗材
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验试剂耗材
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 CD4/CD8 阳性细胞计数
• 2.3.2 血浆 HIV-1 病毒载量检测
• 2.3.3 血浆病毒 RNA 提取
• 2.3.4 cDNA 第一链合成
• 2.3.5 ONE-STEP RT-PCR 扩增
• 2.3.6 巢式 PCR 扩增
• 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.8 PCR 扩增产物回收
• 2.3.9 送公司测序
• 2.3.10 系统进化树的构建
• 2.4 结果和讨论
• 2.4.1 实验结果
• 2.4.2 结果讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 HIV P24 蛋白的新型检测方法
• 3.1 P24 蛋白的表达和纯化
• 3.1.1 实验材料和仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 实验结果
• 3.2 PharmaLink 蛋白柱偶联 P24 蛋白法及核酸文库的筛选
• 3.2.1 实验材料和仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 实验结果
• 3.3 硝酸纤维滤膜法固定 P24 蛋白及 Selex 筛选
• 3.3.1 实验材料和仪器
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.3 实验结果
• 3.4 P24 抗原特异性核酸配基的筛选方法改进
• 3.4.1 实验材料和仪器
• 3.4.2 实验方法
• 3.4.3 实验结果分析
• 3.4 本章结果讨论
• 3.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文
• 致谢