论文摘要
植物耐盐性研究不仅对作物遗传改良有重要意义,而且还是植物基础生物学研究的一个重要组成部分。因此,植物耐盐相关基因的克隆受到人们广泛的关注。近年来,随着分子生物学的迅速发展,科学家们发现并克隆了一些植物耐盐相关基因,但离人们的期望值还相差很远。本研究利用本室的实验材料小麦耐盐品种RH8706-49,根据基因芯片上提供的探针的信息（随着盐胁迫时间的延长表达量呈上升状态）,在NCBI网站通过EST比对进行电子克隆,得到两个含完整ORF区的cDNA序列,通过RT-PCR分别将其克隆,并分别命名为TaMIP（ Triticum asetivum L. Major intrinsic protein）和TaRSP（ Triticum asetivum L.Root specific protein）。本实验重点研究了TaMIP基因,通过DNAstar软件对其生化性质进行了预测,该基因编码300氨基酸的蛋白,分子量32270.40 m.w,等电点7.43。在NCBI网站预测了其保守结构域,含有两个Asn-Pro-Ala（NPA）基序。通过实时定量PCR技术检测TaMIP基因在小麦受到NaCl、ABA、PEG和冷胁迫时的表达模式,TaMIP基因在叶中受到NaCl、ABA、PEG和冷胁迫时表现出不同程度的上调,TaMIP基因在根中受到NaCl、ABA和PEG胁迫时表现出不同程度的上调,而在冷胁迫中受到抑制。同时分别构建了用于定位和功能研究的双元表达载体TaMIP-GFP和TaMIP,并转化了拟南芥。亚细胞定位的结果初步显示该基因定位于细胞膜和细胞质中。通过对转基因拟南芥的萌发率、根长、整体植株的耐盐性的功能研究,显示该基因在一定水平上提高了转基因拟南芥的耐盐性。通过定量PCR技术检测了野生型和转基因拟南芥中耐盐相关基因ADH1、RD29B、KIN2、COR15a和P5CS1,结果显示与对照相比,P5CS1、ADH1、RD29B上调,RD29B上调尤为明显,转基因植株表达量约是野生型的11倍;KIN2和COR15a出现不同程度的下调,转基因拟南芥中COR15a受到严重抑制。通过定量PCR分析CDPK盐通路中FRY1、SAD1基因,FRY1野生型和转基因植株表达量没有变化,SAD1转基因植株与野生型相比轻微上调;SOS盐通路中SOS3、SOS2基因,SOS3的表达量没有变化,SOS2转基因植株与野生型相比下调。根据在拟南芥中过表达TaMIP基因对不同信号通路下游基因的影响作用,推测TaMIP基因可能是盐通路中的下游终端功能基因。用原子吸收法检测了转基因和野生型拟南芥的Na+、K+、Ca2+离子含量,转基因拟南芥中K+、Ca2+含量高于野生型,而Na+离子含量低于野生型,符合植物的耐盐机理。同时检测了转基因和野生型拟南芥的Pro含量,转基因拟南芥的Pro含量高于野生型,符合植物的耐盐机理。