论文摘要
目的:通过对山东临沂、河南、河北等产地的蟾酥有效成分的提取方法、含量、炮制工艺、指纹图谱、炮制前后指纹图谱变化方面进行研究,建立华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的最佳提取方法和含量测定方法、蟾酥最佳酒炮制工艺、蟾酥TLC指纹图谱与HPLC指纹图谱,并比较蟾酥不同炮制样品之间及炮制前后指纹图谱的差别,为蟾酥的炮制规范化、质量控制标准化和进一步的应用开发等提供科学依据。方法:采用HPLC法,以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的提取率为评价指标,分别进行不同溶剂加热回流提取和超声提取比较考察、不同浓度乙醇单因素考察,以及L9（34）正交试验,筛选蟾酥最佳提取工艺,并对蟾酥中的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基进行含量测定。采用HPLC法,以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量为评价指标,选择市售白酒、牛奶、滑石粉作蟾酥炮制辅料单因素考察,并通过L9（34）正交试验进一步考察酒炮制工艺,筛选蟾酥药材最佳炮制工艺。采用TLC法对12批蟾酥药材的薄层图谱进行分析。采用HPLC法进行梯度洗脱,对12批蟾酥药材的指纹图谱进行分析。采用TLC和HPLC指纹图谱法比较蟾酥不同方法及炮制前后指纹图谱的变化。结果:1.蟾酥有效成分最佳提取方法:加入50倍量80%乙醇70℃提取两次,每次90 min。2.建立了华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定方法,并测定了12批蟾酥药材,华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量范围分别是0.937%～4.893%和0.198%～6.692%。3.蟾酥经三种辅料炮制后有效成分含量均有所下降,其中酒炮制后成化变化较小,选择对酒炮制作进一步研究。优选出蟾酥酒炮制最佳工艺是:加入2倍量55%乙醇（白酒）,在60℃下炮制12小时,干燥,粉碎。蟾酥经酒炮制后,有效成分的总含量比原药材降低约20%。4.蟾酥TLC指纹图谱以V环己烷:V二氯甲烷:V丙酮（2:1:1）为展开剂,二次展开结果最佳,可分离出12个紫外荧光斑点和9个可见光斑点,斑点分离度好。不同批次产地的蟾酥样品的斑点数目相同,斑点颜色和大小因产地不同而各有差异。5.测定了12批蟾酥的HPLC指纹图谱,从中标定了26个共有峰,并划分为2个区域,第Ⅰ区（RT=0～20 min）由9个共有峰组成,不同产地蟾酥在此区间峰貌相似;第Ⅱ区（RT=20～40 min）由17个共有峰组成,是体现蟾酥产地差异的主要特征区域。对12批蟾酥进行相似度评价均大于0.9,整体相似度较好,初步建立了蟾酥药材的共有峰模式。6.不同炮制品的TLC指纹图谱薄层行为与蟾酥药材相似。同一批次蟾酥酒炮制和牛奶炮制样品的斑点数目与炮制前基本相同,但斑点颜色较淡;滑石粉炮制样品斑点比该产地生品、酒炮制品和牛奶炮制品的斑点颜色淡,且部分斑点有明显变化。同法对多个批次蟾酥进行对比,结果相似。同一批次蟾酥经不同酒度炮制后,样品斑点数目与生品基本相同,炮制品的斑点颜色较浅,炮制品之间的斑点颜色没有明显差异。7.不同炮制品的HPLC指纹图谱整体面貌与蟾酥药材相似,各共有峰基本存在,保留时间与相对保留时间基本一致,但共有峰强度差别较大。同一批次蟾酥经牛奶和滑石粉炮制后,共有峰相对峰面积变化较大,酒炮制后的共有峰相对峰面积变化较小。同法考察了多个批次蟾酥,结果相似。同一批次蟾酥经不同酒度炮制后,除6号峰的相对峰面积经炮制后有所增加外,其他共有峰的相对峰面积均呈降低的趋势。结论:1.新建的提取方法对蟾酥华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的提取率高于2005版《中国药典》的方法,能够充分提取蟾酥中的有效成分。2.新建的蟾酥有效成分含量测定方法优于2005版《中国药典》的测定方法。3.规范了蟾酥的酒炮制工艺参数,为蟾酥炮制进一步研究提供实验依据。4.蟾酥TLC指纹图谱能分离药材中多个成分,可用于蟾酥药材鉴别及质量评价。5.蟾酥HPLC指纹图谱能够对蟾酥的总体成分进行系统分析,提供了丰富的信息,可用于评价蟾酥药材品质及对质量的全面控制。6.蟾酥TLC指纹图谱和HPLC指纹图谱可用于评价炮制前后蟾酥的成分变化,能从整体上对蟾酥炮制前后各成分的变化情况进行分析。蟾酥炮制后各成分基本呈下降趋势,这可能是蟾酥酒炮制后降毒的原因。7.初步建立了蟾酥炮制品质量标准。若能得到进一步验证,可作为行业中蟾酥炮制质量控制的参考基础和依据。