油菜黑芥子酶基因的大肠杆菌工程菌构建和表达研究

论文摘要

黑芥子酶（EC3.2.1.147）存在于十字花科植物中。在一定的条件下,黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷,生成葡萄糖、硫酸盐、异硫代氰酸盐、乙腈、硫氰酸盐等物质。其中,酶解产物异硫代氰酸盐具有很好的抗肿瘤生物活性。但异硫代氰酸盐在水相中不稳定,易降解失去生物活性。硫代葡萄糖苷的稳定性较好,且黑芥子酶被固定化后,也有很好的稳定性。不过从植物中提取黑芥子酶,产量低,不能满足产品生产的需要。因此,我们利用转基因技术构建合适的工程菌,以期得到大量的、纯度高、有生物活性的黑芥子酶。本实验中,我们尝试将油菜中MYR1基因克隆到原核表达载体中进行异源表达。为了高效表达黑芥子酶,我们采用了pGEX-4T-1表达系统。实验首先从油菜幼苗中提取总RNA,采用RT-PCR法将MYR1编码的成熟肽链基因序列扩增出来。经过克隆测序,与NCBI序列库对比同源性,得知该基因与NO.60214有99%的同源性,氨基酸仅有一个不同。再利用SalⅠ位点与pGEX-4T-1连接,构建成重组子pGEX-4T-1-MYR1。经过PCR鉴定、SalⅠ酶切及EcoRⅠ酶切鉴定以及测序,筛选出重组大肠杆菌。将之在在OD600为0.8、37℃、IPTG浓度为0.08mmol/L的条件下诱导表达2.5h,表达产物经SDS-PAGE初步检测,与空质粒pGEX-4T-1表达产物相比较,其在90KDa处有表达量很高的一条带,但没有获得可溶性的GST融合蛋白,推测是GST融合蛋白大量表达聚集形成了包涵体。通过改变培养条件,在20℃、OD600为0.8左右、IPTG浓度0.02mM下诱导2.5h,液氮破碎后经过浓缩,再用少量的pH6的磷酸缓冲液溶解,我们获得少量可溶的、有活性的GST融合蛋白,以SINIGRIN做底物,测得融合蛋白的比活力为3.1×10-3U/mg。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 黑芥子酶的研究进展
• 1.1.1 黑芥子酶概述
• 1.1.2 黑芥子酶的作用机制
• 1.1.3 黑芥子酶的稳定性
• 1.1.4 黑芥子酶的提取研究
• 1.1.5 黑芥子酶活性的检测方法
• 1.1.6 油菜中黑芥子酶的分子生物学
• 1.1.7 黑芥子酶的基因工程
• 1.2 pGEX表达载体系统
• 1.2.1 pGEX表达系统概述
• 1.2.2 用pGEX载体表达外源蛋白
• 1.2.3 pGEX载体的表达条件及纯化条件
• 1.2.4 pGEX载体在基因克隆中的应用
• 1.3 实验设计方案
• 1.3.1 本实验的目的和意义
• 1.3.2 本研究的主要内容
• 1.3.3 实验流程图
• 第2章 黑芥子酶MYR1基因的克隆及测序
• 前言
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 总RNA电泳图
• 2.2.2 RT-PCR扩增的黑芥子酶基因
• 2.2.3 基因的克隆和测序
• 2.3 讨论
• 第3章 重组子的构建、筛选和鉴定
• 前言
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 黑芥子酶基因MYR1的分离纯化
• 3.2.2 表达载体pGEX-4T-1质粒的提取纯化
• 3.2.3 重组质粒pGEX-4T-1-MYR1的构建
• 3.2.4 表达载体pGEX-4T-1-MYR1的鉴定
• 3.3 讨论
• 第4章 融合蛋白的结构分析、表达和活性测定
• 前言
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 融合蛋白一级结构的确定
• 4.2.2 融合蛋白与甘蓝油菜中黑芥子酶的空间结构对比
• 4.2.3 生长曲线图
• 4.2.4 破碎条件
• 4.2.5 基因工程菌培养条件优化
• 4.2.6 酶活性分析
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1 缩略词表
• 附录2 酶及抗生素的配制
• 附录3 部分试剂的配制
• 附录4 培养基的配制
• 附录5 DNA同源性比较
• 附录6 氨基酸同源性比较
• 致谢