中国合作猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子的克隆及基因结构与多态性分析

论文摘要

主要组织相容性复合体（Major histocopitibility complex,MHC）又称白细胞抗原（LymphocyteAntigen）,是集中于某一染色体、编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因簇,是目前已知的多态性最丰富的基因系统。MHC不仅控制着机体移植排斥反应,还参与机体对内/外源性抗原的识别、结合,与机体获得性免疫应答密切相关。MHC在人类称为HLA,在猪则称为SLA（swine Lymphocyte Antigen）,其中SLAⅠ类和SLAⅡ类是其最重要的经典分子。中国合作猪是由野猪通过自然驯化和人工选择而来的一个地方猪种,主要分布于甘肃省甘南藏族自治州等高原地区,是一个原始地方小型猪种。由于独特的高原气候类型和复杂多样的地形地貌特征,加之交通闭塞、地理隔离以及民族特有的经济、文化活动,保存了许多独特而优秀的遗传性状,耐粗饲、耐严寒、抗病力强,其特有的基因型是其他猪种所不具备的,是我国重要的遗传多样性基因资源库。本研究以商品化白猪和GenBank收录的相关物种的SLA基因作为比较对象,重点研究合作猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子的基因结构及其遗传多态性,探讨其独特的生物学特性与该类分子的关系,为抗病基础研究提供依据。取得的研究结果如下:1、首次成功地克隆了合作猪和商品化白猪SLAⅠ类（SLA-1、-2和-3）和Ⅱ类（DRA、DRB、DQA和DQB）分子的功能基因及其相应的基因组序列,其中SLAⅠ类分子功能基因序列共6个（GenBank登录号为FJ905817～FJ905822）,相应的基因组序列6个（GenBank登录号为FJ905829～FJ905834）;SLAⅡ类分子功能基因序列共8个（GenBank登录号分别为FJ905823、FJ905824～FJ905828）,相应的基因组序列7个（GenBank登录号为FJ905835～FJ905840）。2、系统分析合作猪和商品化白猪SLAⅠ类基因的结构及其多态性,发现SLAⅠ类分子基因可分为五个功能区,其多态性位点主要集中在α1与α2结构域,其中核苷酸非同义置换位点数多于同义置换位点数。SLAⅠ类分子共有21个新的SNPs位点,其中SLA-1有4个,主要位于α2和α3功能区;SLA-2有6个,主要位于α1、α2和α3功能区;SLA-3有13个,主要位于α2和α3功能区。合作猪SLAⅠ类分子共有17个新的SNPs位点,而商品化白猪有6个,说明合作猪的SLAⅠ类分子多态性高于商品化白猪。3、系统分析合作猪和商品化白猪SLAⅡ类基因的结构及其多态性,发现SLAⅡ类分子基因可分为四个功能区,其多态性位点主要集中在α1（β1）结构域,其中DRAα1区仅有一个非同义置换位点,而DQAαβ1区的同义置换位点数多于非同义置换位点数;DRB和DQB的β1区的核苷酸同义置换位点数少于非同义置换位点数。SLAⅡ类分子共有23个新的SNPs位点,其中DRA有5个,主要位于α1区;DQA有6个,主要位于α1和α2功能区;DQB有4个,主要位于β1区、信号肽和穿膜区及胞浆区;DRB有7个,主要位于β1、β2区和穿膜区及胞浆区。合作猪SLAⅡ类分子共有9个新的SNPs位点,而商品化白猪共有13个,说明商品化白猪SLAⅡ类分子的多态性高于合作猪。4、合作猪和商品化白猪SLAⅠ类分子的基因组均由8个外显子和7个内含子组成,基因组结构相似,其中Ⅰ类分子中内含子3片段最长;而SLAⅡ类分子α、β链的外显子和内含子组成有差异,其中DRA和DQA由4个外显子和3个内含子组成,DQB由5个外显子和4个内含子组成,DRB则由6个外显子和5个内含子组成。在SLAⅡ类分子中,DRA、DRB和DOA的内含子1均长丁其他内含子,而DQB较为特别,其内含子2较长。5、合作猪SLAⅠ类分子基因组外显子2和3共有14个新的SNPs位点,其中SLA-2有7个新的SNPs位点主要位于α2功能区,SLA-3有7个新的SNPs位点主要位于α2和α3功能区。而SLAⅡ类分子基因组外显子2共有3个新的SNPs位点,其中DQB有2个新的SNPs位点主要位于β1区,而DRB仅有1个新的SNPs位点主要位于β1区。而Ⅰ类分子基因组的内含子2和3的多态性比较,发现存在单个核苷酸的变异和短片段的缺失。DRA和DQA的内含子1的多态性主要表现也为单个核苷酸的变异和短片段的缺失,但DRB基因内含子1的多态性主要表现为200多个bp长片段序列的插入和缺失,在DQB的内含子2同样具有连续的10多个核苷酸的插入和缺失现象,且其多次出现。因此,合作猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子的内含子组成具有高度的多态性,并远高于其外显子。6、首次完整地克隆和分析了合作猪和商品化白猪SLAⅠ类（SLA-1、-2和-3）和Ⅱ类分子基因（DRA、DRB、DQA和DQB）的上游启动子调控区,并与HLAⅠ类和Ⅱ类分子基因的上游调控区比较,证实其结构类型和排列顺序基本一致。发现SLAⅠ类（SLA-1、-2和-3）基因表达调控有关的调控元件含有SP1、增强子A、干扰素调控因子（ISRE）、W/S盒、X盒、Y盒、CAAT盒和TATA盒,其中CAAT盒高度保守,而其他调控元件均具有多态性;而SLAⅡ类分子基因表达调控有关的元件在基因间则不一致,其中SLA-DRA上游调控区含有部分的Y盒、八聚体复合物和T区等调控因子,均高度保守,但没有发现CCAAT和TATA等区;SLA-DQA上游调控区含有W盒、核因子κ(（NF-κB）/增强子A、S盒、X盒、Y盒和T盒,仅W盒具有多态性;而SLA-DQB和-DRB基因表达调控有关的调控元件一致,均含有W/S盒、X盒、Y盒、CCAAT和TATA盒,其中仅CCAAT盒高度保守,其他均具有多态性。此外,在各调控元件之间分布着多态性位点。7、SLAⅠ类分子基因启动子区多态性分析发现,与参考序列比较共有23个新的SNPs位点,其中合作猪与商品化白猪SLA-2-URR间有14个,主要位于各调控元件之间;合作猪SLA-3-URR有9个新的SNPs位点和1个缺失位点,主要位于各调控元件之间和增强子A及SP1盒中。在SLAⅠ类分子基因启动子区的23个多态性位点中,合作猪有19个,而商品化白猪仅有4个。SLAⅡ类分子基因启动子区共有13个新的SNPs位点,其中DQA-URR有5个,主要位于W盒和W盒:DRB-URR共有8个,主要位于各调控元件之间。说明合作猪SLAⅠ类、Ⅱ类分子基因启动子区具有多态性,且在SLAⅠ类分子高于商品化白猪。8、选择合作猪SLAⅡ类分子的DQA外显子2进行遗传演化关系分析,发现AT含量大于GC含量,核苷酸的非同义置换率高于同义置换率,且ka/Ks＜1,说明DQA基因外显子2序列经受着平衡选择且偏向于阴性选择的影响;用Tajima’s D值进行中性检验发现,Tajima’s D值为0.54649＞0.1（P＞0.10）符合中性突变,说明平衡选择对DQA的进化具有重要的意义,基因序列进化方式为平衡选择,而且有一些单倍型的分化。每个位点的核苷酸置换率Pi（π）和Theta-W的值分别为0.04016和0.03694,且平均碱基配对遗传距离为0.0418±0.0081。总之,对合作猪白细胞抗原的Ⅰ类和Ⅱ类分子基因的分析表明:SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因具有丰富的多态性,且具有单倍型的分化,说明合作猪具有独特的基因型,这可能与其长期适应各种恶劣的自然环境和复杂的病原微生物有关。

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摘要

Abstract

第一部分文献综述

第一章猪MHC分子的研究进展

1.1 猪MHC的发现及特点

1.1.1 MHC的发现

1.1.2 猪MHC的发现

1.2 猪MHC（SLA）的生物学功能

1.2.1 参与T细胞的免疫应答

1.2.2 参与免疫应答的遗传控制

1.2.3 约束免疫细胞间的相互作用

1.2.4 参与抗原处理

1.2.5 参与免疫调节

1.2.6 参与免疫细胞的分化

1.3 SLA分类、特点及组成

1.3.1 SLAⅠ类分子的分布、特点及组成

1.3.2 SLAⅡ类分子的分布、特点及组成

第二章猪MHC分子的多态性

2.1 猪MHC的多态性

2.2 SLAⅠ类分子基因及启动子区的多态性

2.2.1 SLAⅠ类分子基因的多态性

2.2.2 SLAⅠ类基因启动子区多态性

2.3 SLAⅡ类分子及启动子区基因多态性

2.3.1 SLAⅡ类分子基因的多态性

2.3.2 SLAⅡ类基因启动子区的多态性

2.3.3 MHCⅡ类基因启动子的多态性对基因表达调控影响

2.3.4 MHCⅡ类基因启动子多态性的的形成及与疾病的相关性

第三章 SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因与疾病及生产性状的相关性

3.1 SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因组织、细胞表达及与机体免疫水平的相关性

3.2 SLAⅠ类和Ⅱ类分子基因与疾病的相关性

3.3 SLA与生产性状的相关性

3.4 前景展望

第二部分试验研究

第四章合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子CDNA的克隆及序列分析

4.1 实验材料

4.1.1 实验动物

4.1.2 菌种和载体

4.1.3 酶和试剂

4.1.4 仪器与设备

4.1.5 引物

4.2 实验方法

4.2.1 猪脾脏淋巴细胞的分离与培养

4.2.2 总RNA的提取

4.2.3 RT-PCR扩增目的片段

4.2.4 目的基因的克隆

4.2.5 重组质粒的提取与鉴定

4.3 结果与分析

4.3.1 RT-PCR扩增产物

4.3.2 重组质粒的酶切鉴定

4.3.3 测序结果

4.3.4 SLA Ⅰ类分子功能基因的序列分析

4.3.5 SLA Ⅱ类分子功能基因的序列分析

4.3.6 合作猪DR基因的生物信息学分析

4.4 讨论

4.4.1 关于SLA Ⅰ和Ⅱ类分子功能基因序列cDNA水平多态性的探讨

4.4.2 SLA Ⅰ和Ⅱ类分子功能基因多态性对其功能的影响

4.4.3 合作猪DR基因与不同猪种和物种间的同源关系的比较

第五章合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子新等位基因的预测分析

5.1 实验材料

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.3.1 测序结果

5.3.2 SLAⅠ类和Ⅱ类分子新等位基因的预测分析

5.4 讨论

5.4.1 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子等位基因新的SNPs位点的预测

5.4.2 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子新等位基因的预测

第六章合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子基因组DNA的克隆及序列分析

6.1 实验材料

6.1.1 实验动物

6.1.2 菌种和载体

6.1.3 酶和试剂

6.1.4 仪器与设备

6.1.5 引物

6.2 实验方法

6.2.1 猪脾脏淋巴细胞的分离与培养

6.2.2 基因组DNA的提取

6.2.3 SLA基因组的扩增

6.2.4 目的片段的克隆

6.2.5 重组质粒的提取与鉴定

6.3 结果与分析

6.3.1 提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳

6.3.2 合作猪与商品化白猪MHC基因PCR产物

6.3.3 重组质粒的酶切鉴定

6.3.4 测序结果

6.3.5 合作猪和商品化白猪SLAⅠ类分子基因组序列的分析及新等位基因的预测

6.3.6 合作猪和商品化白猪SLAⅡ类功能基因组序列的分析

6.3.7 合作猪DRB基因外显子2序列遗传变异的分析

6.3.8 合作猪DQA外显子2的多态性及其遗传进化的分析

6.4 讨论

6.4.1 关于长片段基因组的克隆的探讨

6.4.2 关于SLAⅠ类分子基因组的结构及其多态性的分析

6.4.3 关于SLAⅡ类分子基因组的结构及其多态性的分析

6.4.4 关于合作猪DRB基因外显子2的多态性的分析

6.4.5 关于合作猪DQA基因外显子2的多态性的分析

6.4.6 关于SLA Ⅰ类分子和Ⅱ类分子基因组中内含子的多态性

6.4.7 合作猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子等位基因新的SNPs位点的预测分析

6.4.8 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子新等位基因的预测

6.4.9 关于抗原结合区编码外显子序列的多态性

第七章合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子上游启动子区序列的分析及新等位基因的预测

7.1 材料

7.2 实验方法

7.3 结果与分析

7.3.1 基因组的克隆和测序

7.3.2 SLA Ⅰ类分子上游启动子区序列的分析及新等位基因的预测

7.3.3 SLA Ⅱ类分子上游启动子区序列的分析及新等位基因的预测

7.3.4 DRB和DQB URR序列的遗传进化关系

7.4 讨论

7.4.1 关于SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子基因启动子区的多态性探讨

7.4.2 关于SLA Ⅰ类分子和Ⅱ类分子基因启动子区各调控元件的功能的探讨

7.4.3 关于SLA Ⅱ类分子基因DQB和DRB启动子区等位基因的分类

7.4.4 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子启动子等位基因新的SNPs位点的预测

7.4.5 合作猪和商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子启动子新等位基因的预测

7.4.6 SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子等位基因上游调控区多态性与基因的表达调控

第八章结论

参考文献

附录1 溶液的配方

TM18-T质粒图谱'>附录2 克隆载体PMD^TM18-T质粒图谱

附录3 克隆载体PGEM-TEASY质粒图谱

附录4 载体PCDNA3.1/CT-GFP-TOPO质粒图谱

附录5 合作猪与商品化白猪SLA Ⅰ类和Ⅱ类分子CDNA序列

致谢

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中国合作猪SLAⅠ类和Ⅱ类分子的克隆及基因结构与多态性分析

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