刀豆凝集素提取分离纯化及性质研究

论文摘要

凝集素（Lectins）是一类非免疫原性、具有糖结合专一性、能凝集细胞和（或）沉淀含糖高分子的蛋白质或糖蛋白。广泛存在于植物、动物和微生物中。本实验以成熟洋刀豆（Canavalia ensiformis （L.）DC）干豆粒为原料,提取、分离纯化刀豆凝集素（Concanavalin A,简称ConA）,并对其性质进行了初步的探索研究。血凝法适宜于凝集素的含量检测,具有操作简便,反应迅速,效果明显,受条件影响较小等优点。实验采用浓度为1.75 U/mL的胰蛋白酶修饰人血红细胞来检测洋刀豆干豆粒中ConA的含量,可使其血凝活力测定值提高三个数量级（8倍）,增加了血红细胞的敏感性以及凝集素活力检测的灵敏度。样品的检测参数为:洋刀豆干豆粒粉碎过60目筛、脱脂剂选用30 60℃沸程的石油醚,脱脂剂与原料的料液比（W/V）为1:8,脱脂时间8 h,样品浸提液选用pH 7.4, 0.01 mol/L的PBS缓冲液。本课题对ConA的提取工艺条件进行了优化研究。根据单因素实验结果设计了三因素三水平的响应面分析实验,得到ConA的提取优化工艺参数为:提取液料比（V/W）为8.88:1,提取时间8.65 h,PBS提取液中含NaCl的离子强度为0.17 mol/L,离心转速为10000 g。最佳工艺条件下提取,得到的ConA比活力为167.61 HU/mg。选择70%饱和度的固体（NH4）2SO4进行分级盐析,ConA比活力提高至237.43 HU/mg。采用DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析进一步分离纯化刀豆凝集素粗提物,得到ConA纯品,纯品在SDS-PAGE凝胶电泳上显示单一的蛋白谱带,测定ConA的亚基分子量为29 600 Da,与Sigma公司的ConA标准品迁移率相同,其总活力回收率为57.06%,比活力较洋刀豆浸提液的初始活力提高了50.15倍,并与Sigma公司的ConA标准品进行了血凝活力的对比测定,两者血凝活力接近,仅相差一个数量级,这说明了本实验所采用的分离纯化方法是可行的。实验针对ConA的性质研究表明:ConA是一种对热较稳定的凝集素,60℃以下时ConA很稳定,100℃保温20 min后,血凝活力完全丧失。在pH值范围5.8 8.3时,ConA的血凝活力较高,当pH >11.9时,血凝活力完全丧失。D-葡萄糖和D-甘露糖是ConA的专一性结合糖。ConA对人的A、B、O、AB四种血型及供血动物（兔,鸡,鸭,鸽,鲤鱼,鲫鱼）的血红细胞均能发生凝集作用,无血型专一性和供体细胞专一性;ConA的血凝活力依赖于Ca2+和Mn2+存在,用EDTA络合ConA中的金属离子,发现ConA的血凝活力丧失,并且这种反应也是可逆的,可通过补充Ca2+和Mn2+,使ConA的血凝活力恢复。氨基酸组成分析表明,除色氨酸（Trp）因水解破坏未被测出外,ConA可测出17种水解氨基酸,其中富含天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）等酸性氨基酸。紫外吸收光谱是凝集素的特征光谱之一,ConA在220 nm到340 nm之间有一个紫外吸收峰,最大峰值在276 nm左右。实验利用内源荧光方法研究了ConA在不同条件下的溶液构象变化和Trp残基微环境的构象特征。研究表明,ConA在天然状态下,激发波长为280 nm和295 nm时,其荧光发射光谱均呈现最大荧光发射峰334 nm。和游离Trp最大荧光强度的波长348 nm相比,蓝移了14 nm,表明Trp残基位于ConA较为疏水区域。pH和变性剂脲都能使ConA的荧光强度降低,但荧光光谱的形状和荧光发射峰的位置没有明显的变化,这说明ConA的结构比较稳定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 刀豆和洋刀豆概述
• 1.1.1 洋刀豆的营养成分
• 1.1.2 洋刀豆的植物学特征
• 1.2 凝集素的研究概况
• 1.2.1 凝集素的定义
• 1.2.2 凝集素在自然界的含量与分布
• 1.2.3 凝集素的分类
• 1.2.4 凝集素的分离纯化
• 1.2.5 凝集素的生物学功能
• 1.2.6 凝集素的应用
• 1.3 刀豆凝集素国内外研究进展
• 1.3.1 刀豆凝集素的概述
• 1.3.2 刀豆凝集素功能性质的研究
• 1.4 立题背景及意义
• 1.5 论文主要研究内容
• 第二章 刀豆凝集素的检测
• 2.1 前言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 实验材料与试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 洋刀豆原料中ConA 的提取
• 2.3.2 刀豆凝集素的血凝活力测定
• 2.3.3 胰蛋白酶修饰人血红细胞对ConA 血凝活力的影响
• 2.3.4 样品检测条件的探讨
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 胰蛋白酶修饰人血红细胞对ConA 血凝活力的影响
• 2.4.2 检测条件对浸提液血凝活力测定值的影响
• 2.5 本章小结
• 第三章 刀豆凝集素的提取工艺探索
• 3.1 前言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 实验材料与试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 测定方法
• 3.3.1 蛋白质浓度测定
• 3.3.2 ConA 血凝活力的测定
• 3.4 刀豆凝集素 ConA 的提取研究
• 3.4.1 ConA 的提取工艺流程
• 3.4.2 ConA 提取工艺参数的单因素实验
• 3.4.3 采用响应面法优化 ConA 的提取工艺
• 3.4.4 硫酸铵分级盐析
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 蛋白质浓度测定的标准曲线
• 3.5.2 ConA 提取工艺单因素分析
• 3.5.3 响应面分析
• 3.5.4 硫酸铵分级盐析测定结果
• 3.6 本章小结
• 第四章 刀豆凝集素的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 实验材料与试剂
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 测定方法
• 4.4 实验方法
• 4.4.1 ConA 粗品的制备
• 4.4.2 DEAE-52 离子交换层析
• 4.4.3 Sephadex G-100 凝胶过滤层析
• 4.4.4 SDS-PAGE 凝胶电泳法纯度检验及亚基相对分子量测定
• 4.5 结果与讨论
• 4.5.1 ConA 的DEAE-52 离子交换层析
• 4.5.2 ConA 的Sephadex G-100 凝胶过滤层析
• 4.5.3 ConA 的纯度检测及相对亚基分子量计算
• 4.6 本章小结
• 第五章 刀豆凝集素的性质研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与仪器
• 5.2.1 实验材料与试剂
• 5.2.2 实验仪器
• 5.3 测定方法
• 5.4 ConA 性质的测定
• 5.4.1 热稳定性的测定
• 5.4.2 酸碱稳定性测定
• 5.4.3 糖结合特异性
• 5.4.4 ConA 对不同类型血红细胞的凝集作用
• 5.4.5 氨基酸组成分析
• 5.4.6 金属离子结合特性
• 5.4.7 ConA 的紫外吸收光谱
• 5.4.8 ConA 的荧光光谱
• 5.5 结果与讨论
• 5.5.1 ConA 的热稳定性
• 5.5.2 ConA 的酸碱稳定性
• 5.5.3 ConA 的糖结合特性
• 5.5.4 ConA 对不同类型血红细胞的凝集作用
• 5.5.5 ConA 的氨基酸组成分析
• 5.5.6 金属离子对ConA 血凝活力的影响
• 5.5.7 ConA 的紫外吸收光谱
• 5.5.8 ConA 的荧光光谱分析
• 5.6 本章小结
• 主要结论
• 研究展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文