分枝杆菌分枝菌酸的反相高效液相色谱分型鉴定技术方法研究

论文摘要

结核病具有高流行性和高传染性,至今仍是一个严重的公共卫生问题。WHO已将结核病作为重点控制的传染病之一,据估计全球约有1/3的人感染结核菌,每秒有1个新增病例（WHO,2006年）。分枝杆菌在微生物分类中属于放线菌目、分枝杆菌科,临床主要致病的是结核分枝杆菌（MTB）,此外还有非结核分枝杆菌（NTM）,NTM所引起的结核样病变与结核临床表现相似,但治疗方案和抗药性根据不同种属有所不同。因此对分枝杆菌做出及时准确的分型鉴定、检测对控制结核病疫情具有十分重要的现实意义。分枝菌酸（MA）是一类高分子量的含有α-支链、β-羟基脂肪酸的化合物,是所有分枝杆菌细胞壁脂质的主要组分,其脂肪酸上碳链的长度、不饱和状态、官能团及其含量与生物种型有关,且各生物种型之间MA呈现指纹特征。本论文的目的是通过采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析比较样品中MA之间的差异,建立快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的HPLC标准方法,并构建分枝杆菌标准菌株的MA指纹谱库,为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。全文分为四章:第一章前言,简要介绍了分枝杆菌分型鉴别及检测方法的研究现状和存在问题,尤其介绍了HPLC方法的应用。并在此基础上提出了本论文的研究目的和研究内容。第二章建立了以甲醇和二氯甲烷为流动相的梯度洗脱RP-HPLC法。分枝杆菌经过接种、培养、皂化、酸化及衍生化后,采用RP-HPLC进行分析,建立了快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的RP-HPLC标准方法。第三章采用第二章所建立的方法,构建了49种《伯杰细菌鉴定手册》中所载入的分枝杆菌标准菌株（来源于ATCC（美国标准菌种收藏中心））的MA指纹谱库。通过对各个谱图进行详细分析,依据峰的分布特点可将其分为单簇（14种）、双簇（23种）、三簇及多簇（12种）三类,而后根据相对保留时间和相对峰高比的比例进行种间水平鉴别。此法成功鉴别了41种分枝杆菌（其余8种难以采用此法准确鉴别）,对于难以鉴别的部分菌种尝试采用GC法对其进行进一步分型鉴别。第四章在完成第二、三章工作的基础上,使用所建立的方法亦测定了大量来源于DSMZ（德国菌种保藏中心）的分枝杆菌（包含未收录入《伯杰细菌鉴定手册》的菌种）的MA指纹图谱,为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 细菌学检验技术
• 1.1.1 涂片抗酸染色法
• 1.1.2 分离培养法
• 1.1.3 噬菌体技术
• 1.2 免疫学诊断法
• 1.3 分子生物学检测法
• 1.4 色谱法
• 1.4.1 薄层色谱法（TLC）
• 1.4.2 气相色谱法（GC）
• 1.4.3 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.5 本课题的研究目的和内容
• 第二章 分枝杆菌分枝菌酸RP-HPLC 标准方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 标准菌株
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 主要溶液
• 2.2.5 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 RP-HPLC 分离条件的选择
• 2.3.2 方法学考察
• 2.4 本章小结
• 第三章 分枝杆菌分枝菌酸指纹谱库的构建
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 标准菌株
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 主要溶液
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 本章小结
• 第四章 其他来源分枝杆菌分枝菌酸指纹谱库的构建
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 菌株（均为CMCC 编号）
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 试剂
• 4.2.4 主要溶液
• 4.2.5 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 来源于DSMZ 的已构建标准谱库的菌种的MA 指纹图谱
• 4.3.2 来源于DMSZ 的未构建标准谱库的菌种的MA 指纹图谱
• 4.3.2.1 单簇MA 指纹图谱
• 4.3.2.2 双簇MA 指纹图谱
• 4.3.2.3 三簇（含多簇）MA 指纹图谱
• 4.3.2.4 其它
• 4.4 本章小结
• 结语
• 参考文献
• 硕士期间发表文章情况
• 英文缩略词对照表
• 致谢