骨髓间充质干细胞对肠辐射损伤的修复作用

论文摘要

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是从骨髓细胞分离出来的一种骨髓基质非造血干细胞,具有很强的自我更新和多向分化的潜能,可以分化为多种间充质组织,并可促进间充质组织的再生。它容易分离获得,可在体外大量扩增且仍保持增殖与分化潜能。此外,MSCs还具有归巢的特性,炎症对其有趋化作用,容易归巢到炎症、损伤部位。因此,MSCs被认为是修复组织损伤的理想种子细胞。辐射损伤发生在临床肿瘤患者的放疗及核恐怖、核事故中,人体中细胞更新、代谢快的组织对辐射尤为敏感,如造血组织、肠道组织。目前直接针对辐射所致的肠道组织损伤尚缺乏有效的治疗方法。辐射导致肠道组织的严重损伤,使消化道的物理屏障和免疫屏障功能丧失,以致肠腔内毒性物质和细菌进入血循环和组织,引起感染,最后甚至导致多器官功能衰竭、死亡,在患者死亡中起决定性作用。已有研究表明MSCs可修复心肌、肌肉、神经等多种组织的损伤,但对修复肠辐射损伤方面的报道还较少。有学者观察到,将绿色荧光蛋白标记的MSCs移植到全身照射的动物模型中可在损伤的肠道等组织检测到,说明MSCs能够迁移定居到损伤的肠道组织。基于以上研究结果我们设计了本课题,首先制备一个肠辐射损伤的模型,通过移植体外扩增、培养的骨髓MSCs,观察MSCs对肠辐射损伤的修复作用。目的:通过建立小鼠肠辐射损伤模型,观察小鼠骨髓来源的间充质干细胞在小鼠肠道辐射损伤修复中的作用。方法:1.SPF级6-8周龄C57 BL/6小鼠,本实验中,辐射损伤模型制备为雌性C57BL/6小鼠,体外细胞培养、移植观察全部用雄性C57 BL/6小鼠。2.利用MSCs体外贴壁生长的特性,体外培养C57 BL/6雄性小鼠的骨髓MSCs获得较纯的骨髓MSCs,通过诱导其向脂肪细胞、成骨细胞分化的方法进行鉴定。3.将受鼠C57 BL/6雌性小鼠随机分成照射对照组（组Ⅰ）、骨髓单个核细胞组（组Ⅱ）和骨髓MSCs+骨髓单个核细胞组（组Ⅲ）,给予13.5Gy60Coγ射线全身致死量照射建立肠辐射损伤模型,组Ⅰ不做处理,组Ⅱ2h内通过尾静脉移植C57 BL/6雄性小鼠的骨髓单个核细胞106/ml,组Ⅲ2h内通过尾静脉移植骨髓MSCs106/ml和骨髓单个核细胞106/ml。观察各组小鼠生存时间、4周的生存率、病理切片等指标,并用PCR检测雌性受鼠体内Y染色体的sry基因,确定供体干细胞的植入情况。4.应用SPSS11.5软件分析数据,结果用均数±标准差（（?）±SD）或百分率表示,样本均数间比较采用单向方差分析（One-Way ANOVA）,多重比较采用LSD（Lest-significant Difference）法。以Kaplan生存曲线描述各组小鼠生存时间。P≤0.05为差异有统计学意义。结果:1.予13.5Gy60Coγ射线全身致死量照射后小鼠出现明显的脱毛,弓背,消瘦,活动明显减少,对刺激反应减弱。取其小肠组织作病理切片,大体观察见其肠壁明显变薄,肠系膜充血、淤血,肠粘膜充血。HE染色后光镜下可见大片小肠黏膜上皮细胞坏死崩解,胞核肿胀淡染,上皮广泛坏死剥脱,绒毛萎缩短秃,大量炎症细胞侵润,未见新生的腺窝细胞,符合肠损伤标准。2.小鼠骨髓MSCs原代细胞培养48h后,首次换液,去除悬浮细胞,倒置显微镜下课件细胞贴壁,多呈圆形,培养至7-8d时,细胞呈梭形,可见大小不一的细胞克隆,呈漩涡状生长,培养至10-11d时,细胞融合成单层,排列具有方向性,待细胞达80%融合时,即可传代,传代后细胞增迅速,杂质细胞也进一步被清除。在成脂诱导液加入后72h,细胞中开始出现小脂滴,主要集中于细胞核周围,随着诱导时间延长,脂滴逐渐聚集成大的脂泡,油红0染色可见脂滴呈深橙红色。在成骨培养基中维持培养25d左右,出现明显高于周围细胞表面的骨结节样结构,茜素红染色显示出明显的红色钙结节。3.组Ⅰ的10只小鼠均于照射后7d死亡,平均生存时间为4.20天（4.20±0.79）,生存率0/10。组Ⅱ的10只小鼠除2只于移植后7d死亡,其余均于移植后2周内死亡,平均生存时间为11.00天（11.00±2.31）,生存率0/10。组Ⅲ的10只小鼠中只有2只于28d内死亡,其余存活时间超过了28d（视为长期存活）,平均生存时间为27.20天（27.20±1.75）,生存率8/10。采用单向方差分析比较各组间平均生存时间,差异有统计学意义（F=464.232,P＜0.001）,采用LSD法分别比较组Ⅲ、组Ⅱ、组Ⅰ的生存时间,差异有统计学意义（P＜0.001）。病理切片显示组Ⅱ小鼠肠道黏膜损伤严重,与组Ⅰ比较无明显修复现象,而组Ⅲ小鼠肠道黏膜结果基本正常,损伤有明显修复现象。PCR检测组Ⅲ小鼠小肠细胞内有Y染色体特异性序列的存在,而检测组Ⅱ各小鼠的此基因片段均为阴性,证实雄性小鼠骨髓MSCs参与了受体小鼠的肠道修复。结论:1.给予C57 BL/6小鼠13.5Gy60Coγ射线全身致死量照射后可制备出可靠的肠损伤动物模型。2.应用密度梯度离心、贴壁培养法相结合的方法可以获得较纯的骨髓MSCs。3.骨髓单个核细胞移植仅能恢复造血损伤,加用骨髓MSCs除可修复造血损伤外还可修复肠道辐射损伤,为骨髓MSCs用于修复肠道辐射损伤提供了实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 正文
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 附图
• 参考文献
• 附录（缩略词）
• 成果
• 综述
• 致谢
• 统计学证明