鸡传染性法氏囊病毒的分离鉴定及其免疫组化检测方法的建立

论文摘要

传染性法氏囊病（IBD）是一种危害鸡的急性、高度接触性、病毒性传染病。除引起3-6周龄易感鸡发生死亡外,可致雏鸡免疫抑制,导致鸡群对新城疫、马立克氏病及传染性支气管炎等多种主要疫病的免疫失败。近年来安徽部分地区此病发生有上升趋势,给当地养殖业带来巨大危害。为了更好的预防本病的发生、准确的诊断此疾病,减少此病对养殖业的危害,研究本病的在安徽的发展已经迫在眉睫。有鉴于此,实验通过以下三个方面对本病进行了研究:首先,从安徽合肥周边此病爆发严重的地区采集疑似法氏囊病例的法氏囊、脾脏等病料组织,接种鸡胚尿囊腔,分离病毒,并用琼脂扩散试验和金胶条试纸进行检测,结果分离到四株IBDV,分别命名为IBD-1、IBD-2、IBD-7和IBD-9株。对分离的病毒进行了动物回归试验与免疫指数测定试验,初步判定IBD-1株为中强毒株。然后,利用临床中分离的病毒IBD-1制备免疫原,免疫家兔制备兔抗鸡IBDV高免血清,抗体的效价为1:128。采用盐析、透析的方法对所制的高免血清进行纯化,采用Folin-酚法和紫外分光光度法检测纯化前后蛋白浓度,纯化后血清蛋白浓度达到12mg/mL以上。经SDS-PAGE电泳检测,可见纯化后的血清IgG出现两条带,分别为其重链和轻链,重链（H链）的分子量大约为53KD,轻链（L链）的分子量为23KD。结果表明,纯化后的血清IgG达到了电泳纯,提纯效果良好。利用制得的IBDV抗体检测安徽地区临床疑似IBD病例,与标准IBDV阳性血清进行比较,阳性符合率达到90%以上。为我们进一步进行免疫组化研究IBDV的抗原分布规律提供了必需的抗体。最后,将IBD-1分离株接种CEF细胞,观察IBDV感染后细胞病变,进行免疫组化染色,摸索抗体最佳浓度。后又将病毒接种28日龄非免疫鸡,分别于接种后7d,14d剖杀采集病料组织,进行组织免疫组化染色,检测鸡法氏囊、脾脏、心脏、肝脏等组织中IBDV的分布。并对相关试验条件进行优化,为研究IBDV感染雏鸡后体内的抗原定位和动态分布规律,阐明IBDV对雏鸡的致病机理提供科学数据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 常用中英文缩写
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 IBDV野毒株的分离鉴定
• 1.2.2 传染性法氏囊病抗体的制备和纯化
• 1.2.3 免疫组化法检测IBDV方法的建立和试验条件的优化
• 2 结果与分析
• 2.1.IBDV野毒株的分离鉴定
• 2.1.1 发病鸡的临床症状及病料采集
• 2.1.2 琼脂扩散试验
• 2.1.3 免疫胶体金试纸检测
• 2.1.4 病毒分离
• 2.1.5 动物回归试验
• 2.1.6 组织病理学观察
• 2.2 传染性法氏囊病抗体的制备和纯化
• 2.2.1 抗体检测
• 2.2.2 IgG的提取和纯化
• 2.2.3 SDS-PAGE电泳法检测提纯前后蛋白质纯度
• 2.2.4 临床应用试验
• 2.3 免疫组化法检测鸡传染性法氏囊病毒方法的建立和优化
• 2.3.1 IBDV囊毒在鸡胚的传代
• 2.3.2 IBDV感染CEF细胞
• 2.3.3 IBDV感染的CEF细胞的免疫组化染色
• 2.3.4 组织的免疫组化染色
• 2.3.5 免疫组化染色方法的优化
• 2.3.6 特异性试验
• 3 讨论
• 3.1 IBDV野毒株的分离鉴定
• 3.2 传染性法氏囊病抗体的制备和纯化试验
• 3.3 免疫组化法检测鸡传染性法氏囊病毒方法的建立和优化试验
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介