抵抗素下调线粒体数量的受体信号途径研究

论文摘要

抵抗素（resistin）是机体内非常重要的一类脂肪细胞因子,可作用于脂肪,肝脏,骨骼肌,并与胰岛素抵抗,炎症反应密切相关,影响糖脂代谢,并参与机体的能量调节。线粒体是机体内进行三羧酸循环及脂肪氧化磷酸化的重要场所,与能量代谢密切相关。近些年的研究表明,线粒体功能在肥胖,糖尿病以及胰岛素抵抗的个体中均受到损伤,甚至有线粒体数量减少的现象出现。已有研究表明resistin可以显著下调线粒体的数量,并且呈现浓度依赖性,并且影响脂肪酸氧化,促进脂肪积累。但是resistin的受体以及下调线粒体数量的具体途径并不清楚。本研究采用RT-PCR, Western Blot,双荧光报告系统和细胞转染等实验技术,研究resistin作用的受体及下调线粒体数量的信号通路。结果如下：1.在HepG2细胞中,用TLR4抗体封闭TLR4后,resistin仍可以下调线粒体数量,而用Decorin的活性抑制剂处理细胞,resistin也仍然可以下调线粒体,而基因芯片结果表明ROR1在resistin处理的hepG2细胞中不表达,表明resistin在hepG2细胞中下调线粒体的作用不是通过这三个受体。2. Resistin刺激hepG2细胞后,cAMP水平得到显著上升,而cGMP水平没有明显变化。通过先关抑制剂实验表明resistin通过激活蛋白激酶C（PKC）,从而激活蛋白激酶G（PKG）,且不依赖于cGMP信号途径。3.通过基因芯片技术及RT-PCR实验,证明resistin通过NF-κB信号途径发挥作用。超表达p65可以下调线粒体的数量,而用RNAi技术干扰p65则可以挽救线粒体数量被resistin下调的现象。此外,通过构建p65点突变载体和抑制剂实验表明,p65可以被PKG磷酸化激活,其磷酸化位点可能是p65的Thr464位点。4.在HEK293细胞中超表达p65,则发现pgc1α的表达量下降；而用RNAi技术干扰p65,则发现pgc1α的表达量上升；并且超表达PGC1α可以上调HEK293细胞中线粒体的含量。通过PLA实验证明p65和PGC1α是相互结合的,并且resistin促进其结合,而PKG的抑制剂KT5823则抑制两者结合。研究还发现resistin抑制PGC1α启动子活性,并且呈现浓度依赖性,而p65则通过与PGC1α结合而抑制PGC1α的自激活,从而抑制启动子的活性。5.运用RNAi技术,RT-PCR等实验探索resistin作用于PKC上游的信号通路。实验表明核转录因子p62被敲减后,可以阻碍resistin下调线粒体数量。此外,resistin下调线粒体可能是通过TNFR1发挥作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 肥胖与脂肪组织
• 1.2 抗素（resistin）
• 1.2.1 抗素的发现及生物学特征
• 1.2.2 Resistin的受体研究
• 1.2.3 Resistin与糖脂代谢
• 1.2.4 Resistin与炎症反应
• 1.3 ACG蛋白激酶
• 1.3.1 蛋白激酶A家族（PKA）
• 1.3.2 蛋白激酶C家族（PKCs）
• 1.3.3 蛋白激酶G家族（PKG）
• 1.4 线粒体
• 1.4.1 线粒体介导脂质代谢
• 1.4.2 线粒体促进脂肪组织生热
• 1.4.3 线粒体功能紊乱与肥胖
• 1.5 研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验细胞及动物
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.2 实验用仪器、试剂以及溶液配制方法
• 2.2.1 实验用仪器
• 2.2.2 实验用试剂
• 2.2.3 主要溶液配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养及转染
• 2.3.2 质粒的大量提取
• 2.3.3 基因组总DNA提取
• 2.3.4 总RNA提取,纯化,鉴定及反转录
• 2.3.5 基因克隆及点突变载体的构建
• 2.3.6 Western blot
• 2.3.7 siRNA的构建
• 2.3.8 实时定量PCR
• 2.3.9 PGC1α启动子活性的检测
• 2.3.10 试剂盒使用说明
• 2.3.11 相关抑制剂及抗体处理细胞
• 3 结果与分析
• 3.1 Resistin疑似受体的功能验证
• 3.2 Resistin经由PKC激活PKG
• 3.2.1 PKA不参与resistin调控线粒体
• 3.2.2 Resistin激活PKC和PKG
• 3.2.3 Resistin经由PKC激活PKG
• 3.3 Resistin下调线粒体通过激活NF-κB信号途径
• 3.3.1 基因芯片技术研究resistin可能作用的信号途径
• 3.3.2 Resistin下调线粒体数量通过激活NF-κB信号途径
• 3.3.3 Resistin下调线粒体数量通过激活P65
• 3.3.4 Resistin经由PKG激活p65
• 3.4 Resistin抑制PGC1α
• 3.4.1 超表达PGC1α挽救线粒体数量被resistin下调
• 3.4.2 Resistin促进p65与PGC1α相互结合
• 3.4.3 p65下调PGC1α启动子的活性
• 3.5 Resistin受体信号途径的进一步探索
• 3.5.1 p62参与resistin对线粒体数量的调控
• 3.5.2 TNFR1可能参与resistin对线粒体数量的调控
• 4 讨论
• 5 结论与创新点
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 参考文献
• 研究生在读期间论文发表的情况
• 致谢