植物疫害生物分子检验检疫技术研究与固相化检测试剂盒研制

论文摘要

本博士论文针对国内外植物疫害生物急需相应检疫检验技术体系和快速检测试剂(盒)的现状，选择严重影响农业生产安全的柑桔溃疡病菌、亚洲柑桔韧皮部杆菌、小麦矮腥黑穗菌和马铃薯种传病毒等为靶标疫害微生物，依据专有基因序列设计特异性引物／探针，利用简易快速、高效排抑的膜分离样品制备方法，建立了靶标疫害微生物特异、准确的免疫诊断和PCR检验检疫技术体系，并基于独创的生物大分子稳定剂创制新型固相化分子诊断试剂盒，并用于近缘种类的甄别、田间病害早期诊断和疫情动态监测。对于增强我国防范农业植物外来疫害入侵和扩散的检疫监控能力，提高我国农业植物疫害生物检验检疫技术整体水平，确保中国农产品的安全生产，促进中国农产品顺利出口具有重要意义。 (1) 柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)引起的柑桔溃疡病是严重影响全世界柑桔生产的重大检疫性病害。本研究选择Xac独有蛋白基因序列分别设计筛选出特异性引物对(JYF5／JYR5)，建立了柑桔溃疡病菌常规PCR检测技术，经反复测试结果表明能够稳定地特异性检出柑桔组织表面所带溃疡病菌的DNA靶带(413 bp)。而对柑桔叶面附生的非致病性黄单胞菌、野油菜黄单胞菌等近缘种以及健康柑桔样品都不能扩增出该靶带；靶细菌DNA检测下限为1.56 pg／μL，细菌悬浮液检测下限为10 cfu／μL；在不同PCR仪及各种控温方式下都能稳定地扩增出特征性靶带，说明该检测技术已经成熟稳定。以插入Xac靶序列片段的重组质粒DNA或溃疡病菌菌液或显症材料作为阳性对照样品，以盆栽柑桔实生苗作为阴性对照样品，利用建立的PCR技术和固相化检测试剂盒对南方柑桔主产区的柑桔叶片、枝条和果实样品统一制样进行了实际检测，结果与各地实际病害发生一致。 (2) 柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)由难以人工培养的韧皮部杆状细菌所引起，是严重影响世界柑桔产业的重要检疫性细菌病害之一。该病可以通过罹病接穗嫁接、带菌柑桔木虱(Diaphorina citri)取食健株新梢以及罹病柑桔种苗远距离传播。利用克隆测序的16S rDNA核糖体蛋白基因序列片段比对分析，设计靶序列特异引物对和荧光探针，建立并优化了柑桔黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)的常规PCR、荧光染料和TaqMan探针定量PCR反应体系，分别测评了检测特异性、灵敏度以及准确度，结果表明TaqMan探针PCR对于靶标病原菌的检测特异性最强，但检测成本较高；SYBR Green Ⅰ染料法的检测灵敏度最高，常规PCR、TaqMan探针法、SYBR Green Ⅰ染料法对靶片段序列DNA的检测下限依次为43.90fg／μl、4.39fg／μl、0.44fg／μl，定量PCR检测灵敏度较常规

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 植物检疫问题的由来
• 1.1.2 靶标疫害生物检验检疫技术研究意义
• 1.1.3 国内外植物疫害生物检疫检验技术发展趋势
• 1.2 研究目的和意义
• 1.3 研究目标和总体设计
• 1.3.1 研究目标
• 1.3.2 研究思路构架
• 1.4 研究的主要内容及技术路线
• 1.5 本研究的创新性
• 2 文献综述
• 2.1 柑桔溃疡病（Citrus Bacterial Canker Disease）及其检疫检验
• 2.1.1 病害发生历史与经济重要性
• 2.1.2 病害循环与寄主范围
• 2.1.3 柑桔溃疡病菌的分类及命名变更
• 2.1.4 柑桔溃疡病菌的基因组研究进展
• 2.1.5 柑桔溃疡病菌的检疫检验技术
• 2.1.6 病害根除计划与检疫除害
• 2.2 柑桔黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）
• 2.2.1 病害发生及经济重要性
• 2.2.2 柑桔黄龙病综合治理
• 2.2.3 柑桔黄龙病病原菌研究历史与现状
• 2.2.4 柑桔黄龙病诊断鉴定
• 2.3 小麦矮腥黑穗病（Dwarf Bunt Disease of Wheat）
• 2.3.1 病害发生分布与经济重要性
• 2.3.2 TCK的生物学特性
• 2.3.3 TCK的传统检验检疫技术
• 2.3.4 真菌差异基因筛选与克隆技术研究
• 2.3.5 腥黑穗菌分子鉴别技术
• 2.4 马铃薯病毒病（Potato Virus Diseases）及其 RT-PCR同步检测
• 2.4.1 病害发生及经济重要性
• 2.4.2 马铃薯病毒检测技术研究现状
• 2.4.3 核酸斑点杂交技术（NASH）
• 2.4.4 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 3 柑桔溃疡病分子检测技术研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.3 实际检测与准确性验证
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 特异性引物在核苷酸序列数据库中同源性比对结果
• 3.3.2 PCR反应条件和扩增程序优化结果
• 3.3.3 PCR检测的性能
• 3.3.4 扩增靶 DNA片段的特异性鉴定
• 3.3.5 柑桔溃疡病菌重组阳性对照的建立
• 3.3.6 柑桔溃疡病实际应用检测效果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 溃疡病菌不同引物对的检测性能比较
• 3.4.2 靶标片段的克隆与测序
• 3.4.3 PCR样品制备
• 3.4.4 无害化参照体系的构建与意义
• 3.5 本章小结
• 4 柑桔黄龙病菌分子检测技术研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 供试柑桔样品和柑桔木虱
• 4.2.2 DNA阳性对照品LA靶片段的重组质粒 DNA克隆转化
• 4.2.3 PCR引物和探针来源与序列
• 4.2.4 柑桔黄龙病 DNA样品制备方法比较
• 4.2.5 柑桔黄龙病菌 PCR扩增体系
• 4.2.6 柑桔黄龙病的实际检测与果园动态监测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 柑桔黄龙病高效制样技术
• 4.3.2 常规 PCR的检测性能
• 4.3.3 常规 PCR检测灵敏度
• 4.3.4 柑桔黄龙病 PCR检测体系优化
• 4.3.5 柑桔黄龙病田间PCR实际检测
• 4.3.6 实时荧光 PCR的检测性能
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 5 小麦矮腥黑穗菌差异基因克隆与 PCR检验检疫技术
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.2.3 差异 DNA片段的RAPD引物介导的半特异性 PCR法筛选与克隆
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 TCK、TCT冬孢子萌发结果
• 5.3.2 基因组 DNA的提取结果以及定量
• 5.3.3 RAPD引物介导的半特异性 PCR法筛选差异 DNA片段
• 5.4 讨论
• 5.4.1 RAPD引物介导的半特异性 PCR法筛选差异基因分析
• 5.4.2 差异基因片段的同源性分析
• 5.5 小结
• 6 马铃薯种苗病毒同步分子检测技术研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料与方法
• 6.2.1 供试材料
• 6.2.2 方法
• 6.3 研究结果与分析
• 6.3.1 马铃薯病毒ssRNA的提取
• 6.3.2 马铃薯病毒的两步法 RT-PCR检测
• 6.3.3 多重RT-PCR检测
• 6.3.4 RT-PCR扩增产物的克隆与测序
• 6.3.5 RT-PCR对马铃薯病毒检测性能测定
• 6.3.6 两步法多重RT-PCR检测试剂盒及实际运用
• 6.4 讨论
• 6.4.1 马铃薯病毒RNA的快速制备方法
• 6.4.2 两步法RT-PCR检测体系
• 6.4.3 检测体系的稳定性，特异性与灵敏度
• 6.5 本章小结
• 7 固相化分子检测试剂盒研制与测评
• 7.1 前言-诊断检测试剂的共性问题
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 供试靶标生物及试剂
• 7.2.2 试验方法
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 生物活性大分子稳定剂的组成优化
• 7.3.2 不同贮存方式对贮存效果的影响
• 7.3.3 固相化检测试剂盒的研制与应用
• 7.4 本章小结
• 8 结论与展望
• 8.1 主要结论
• 8.2 论文创新点
• 9 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 A
• 附录 B
• 附录 C
• 附录 D
• 附录 E
• 附录 F
• 附录 G
• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书