论文摘要
【研究背景和目的】:哮喘是严重危害人类健康的常见慢性呼吸道疾病之一,近年来其发病率呈逐年增加趋势,目前尚无有效根治方法。近年来研究认为:哮喘是一种复杂的异质性疾病,其主要病理特征是气道慢性炎症,其发病的核心机制之一是在炎症反应过程中CD4+T淋巴细胞活化异常,Th2反应增强,导致细胞因子失衡;但具体调控机理尚未完全阐明。Bic/miR-155基因敲除小鼠CD4+T细胞活化出现了异常,T细胞反应明显减弱;被破伤风抗毒素（Tetc）免疫的该小鼠的脾脏细胞在体外Tetc刺激的过程中不能产生特异的IL-2和IFN-γ;且该小鼠在饲养320天之后出现了与哮喘患者类似的气道重塑。这提示miR-155的缺失能够造成细胞因子失衡并可能与哮喘的发病有关。然而Bic/miR-155基因敲除导致IL-2减少的作用机制尚未得到阐明。由于IL-2主要由T细胞在活化过程中产生,T细胞的活化需要TCR及共刺激分子双信号的参与,我们认为IL-2产生的减少可能是由于bic/ miR-155敲除的T细胞高表达了负向共刺激分子。BTLA和CTLA-4作为两个非常重要的Ig超家族的共抑制受体,均被证明能够在CD4+T细胞活化过程中起到重要的负性调节作用;相关研究表明CTLA-4基因的多态性与哮喘的发生关系密切,BTLA也能够调节肺脏T细胞的生存从而调节气道炎症的持续时间;因此CTLA-4、BTLA均有可能是miR-155调控T细胞活化并参与哮喘发病的重要靶标。为了验证BTLA、CTLA-4是否为miR-155在T细胞活化中的功能靶标,我们设计了该实验。【实验方法】首先:通过权威预测软件TargetScan、miRanda和Pictar明确BTLA和CTLA-4 3’-UTR是否存在miR-155的结合位点。然后在确认存在结合位点的基础上,通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-155对靶标3’-UTR有无直接抑制作用。分别构建含BTLA 3’-UTR全长和CTLA-4 3’-UTR全长的双荧光素酶报告基因载体:分别从小鼠基因组中扩增出其3’非编码区（UTR）全长,设计引物将其与目标载体（pEZX-MT01）定向连接,转化细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性克隆并测序。利用测序验证3’-UTR报告基因载体克隆成功;转染细胞:利用Fugene HD随机将含靶标3’-UTR质粒载体与或空质粒载体分别与miR-155 mimics或mimics阴性对照共转染至HEK293T细胞,孵育24小时后分别收集细胞。与海肾荧光素酶报告基因的活性相比较,通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞萤火虫荧光素酶的相对活性。再次在明确miR-155能够调控靶基因3’-UTR的基础上,首先观察基础状态的na（?）ve CD4+T细胞活化前后miR-155及靶标分子的表达变化;然后观察miR-155在CD4+T细胞中对靶标是否具有转录后调控作用。用淋巴细胞分离液分离小鼠淋巴细胞,将其随机分为两组,分别通过NucleofectorTM电转染的方法将miR-155 inhibitor或inhibitor阴性对照转染至淋巴细胞中。16小时之后通过免疫磁珠分选的方法分选各组的na（?）ve CD4+T细胞。将分选后的细胞通过抗CD3、抗CD28双抗体进行体外活化培养;流式细胞仪检测各组活化细胞的细胞表面分子的表达率,Real-time RT-PCR检测各组细胞相关基因的表达,Elisa检测细胞上清中IL-2的表达。【实验结果】（1）TargetScan和miRanda均预测BTLA、CTLA-4为miR-155的靶点,成功构建含小鼠BTLA 3’-UTR或CTLA-4 3’-UTR全长的双荧光素酶报告基因载体。（2）双荧光素酶报告基因荧光素酶活性检测结果为:与阴性对照和3’-UTR全长载体共转染相比较,miR-155 mimics与BTLA 3’-UTR全长或CTLA-4 3’-UTR全长共转染组萤火虫荧光素酶活性均明显降低（P<0.001,P<0.001）;而与阴性对照和空载体共转染相比较,miR-155 mimics与空载体共转染组萤火虫荧光素酶活性无明显差异。（3）活化后na（?）ve CD4+T细胞miR-155及CTLA-4、BTLA的表达均较活化前增加。体外转染实验结果显示:与inhibitor阴性对照（Ctrl）组相比较,miR-155 inhibitor组细胞miR-155的表达明显下调（P<0.05）,细胞表面BTLA、CTLA-4的表达率则明显升高（P<0.001, P<0.001）,而两组细胞BTLA、CTLA-4的mRNA的相对表达量均无明显变化;两组细胞表面CD69的表达率、细胞上清中IL-2的表达水平无明显差异。【结论】BTLA、CTLA-4均是miR-155在CD4+T细胞活化过程中的重要靶点。BTLA和CTLA-4作为负向共刺激分子均能够抑制CD4+T细胞活化,miR-155可能通过抑制BTLA及CTLA-4的表达促进CD4+T细胞的活化。另外,CTLA-4与过敏性疾病关系密切,通过BTLA信号调节细胞的死亡也是肺脏炎症反应的关键决定因素;这提示miR-155可能通过作用二者参与哮喘的发病。本研究丰富了miR-155通过靶向作用于负向共刺激分子调控T细胞活化的理论,并且可能为治疗哮喘提供新思路。