Escherichia coli K12 tktA基因的克隆及其在Zymomonas mobilis CP4中的表达

论文摘要

木糖是仅次于葡萄糖的自然界最丰富的糖分,利用微生物发酵转化木糖生产乙醇是当前的研究热点之一。运动发酵单胞菌对糖的摄取速度和发酵产醇速度均优于酿酒酵母,因此被人们认为是极具开发潜力的乙醇生产菌。运动发酵单胞菌没有转醛醇酶活性,转酮醇酶活力低,缺乏完整的磷酸戊糖途径,因而不能利用木糖发酵生醇。通过转入并表达转酮醇酶等基因,可使运动发酵单胞菌利用木糖发酵生醇。转酮醇酶是磷酸戊糖途径的关键酶之一,提高体内转酮醇酶活力可以提高基因工程菌的木糖发酵效率。本论文首先通过紫外诱变、一系列筛选平板和转酮醇酶活力测定获得了转酮醇酶营养缺陷型菌株E. coli tkt-7#。然后通过PCR克隆E. coli K12 tktA,并以pUC19为载体转化E. coli tkt-7#。得到的转化子能够在M9+Pro+A+X+aroAA筛选平板上生长,其转酮醇酶活力也比tkt-7#的转酮醇酶活力高出100倍。通过核酸测序进一步证实克隆得到的DNA片段为tktA（携带自身启动子）。为了使tktA能够在Z.mobilis CP4更好的表达,本论文还通过PCR重叠延伸技术构建了Peno-tktA,其中Peno是Z.mobilis CP4体内的强启动子。最后以穿梭质粒pZB1为载体,使tktA（携带自身启动子）和Peno-tktA分别在Z.mobilis CP4体内表达。结果表明在Z.mobilis CP4体内Peno-tktA能够更高效地表达,其转酮醇酶活力为tktA（携带自身启动子）表达的100多倍。本论文测定转酮醇酶活力时只加入了一种底物D-核糖-5-磷酸,而另一底物D-核酮糖-5-磷酸是利用待测酶自身粗酶体系或外加的转酮醇酶缺陷型E. coliBJ502粗酶体系中D-核糖-5-磷酸异构酶和D-核酮糖-5-磷酸差向异构酶将部分D-核糖-5-磷酸转化得到的。另外通过两次核酸测序,发现本论文中采用的tktA模板（来自CGSC赠送的E.coli K12）与“Escherichia coli K12 MG1655 section 266of 400 of the complete genome”（gb|AE000376.1|AE000376）相差3个碱基。

论文目录

前言

第一章文献综述

1.1 磷酸戊糖途径及转酮醇酶的研究

1.1.1 磷酸戊糖途径的发现

1.1.2 磷酸戊糖途径的功能

1.1.3 转酮醇酶的发现

1.1.4 转酮醇酶在生物代谢中的作用

1.1.5 转酮醇酶在磷酸戊糖途径中的作用

1.1.6 转酮醇酶营养缺陷型

1.1.7 转酮醇酶的特性和保守序列

1.1.8 影响转酮醇酶活力的因素

1.1.9 E．coli转酮醇酶活力测定方法

1.1.10 转酮醇酶的工业应用

1.2 转酮醇酶基因的研究

1.2.1 转酮醇酶基因的研究

1.2.2 转酮醇酶基因的基因工程研究

1.3 Z．mobilis CP4 基因及其调控研究

1.3.1 Z．mobilis的简介

1.3.2 Z．mobilis糖代谢基因及其调控研究

1.4 本课题的研究目的、内容和技术路线

1.4.1 研究目的

1.4.2 研究内容

1.4.3 技术路线

第二章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 培养基及常用溶液的配方

2.1.4 蛋白质含量测定试剂

2.1.5 酶活测定试剂

2.1.6 PCR 反应用引物

2.1.7 主要设备及仪器

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的培养

2.2.2 转酮醇酶营养缺陷型的构建

2.2.3 粗酶液（无细胞提取液）的制备与存储

2.2.4 蛋白质浓度测定

2.2.5 转酮醇酶活力测定

2.2.6 PCR 反应

2.2.7 酶切反应

2.2.8 电泳分析

2.2.9 核酸共沉剂回收DNA 片段

2.2.10 目的条带的回收

2.2.11 连接反应

2.2.12 感受态细胞的制备及转化

2.2.13 质粒的小量提取

第三章实验结果与讨论

3.1 紫外诱变和转酮醇酶营养缺陷型菌株的筛选

3.1.1 紫外诱变和转酮醇酶营养缺陷型菌株的筛选

3.1.2 转酮醇酶营养缺陷型疑似株的酶活测定

3.2 E．coli K12 tktA 基因的克隆

3.2.1 PCR 反应克隆 E．coli K12 tktA 基因（携带自身启动子）

3.2.2 pUC19-tktA 的构建

3.3 E．coli K12 tktA 基因在Z． mobilis CP4 中的表达

3.3.1 pZB1-tktA 的构建

3.3.2 pZB1-Peno-tktA 的构建

3.3.3 tktA 和Peno -tktA 在Z． mobilis CP4 中的表达

3.3.4 基因表达对细胞生长影响的初步观察

第四章结论

4.1 结论

4.2 建议

参考文献

发表论文和科研情况说明

附录一:PCR 产物1物理图谱

附录二:pUC19 物理图谱

附录三:pUC19-tktA 物理图谱及其酶切电泳模拟图

附录四:pUC19-tktA 测序结果

附录五:pZB1 物理图谱

附录六:pZB1-tktA 物理图谱及其酶切电泳模拟图

附录七:PCR 产物5物理图谱

附录八:pUC19-Peno-tktA 物理图谱及其酶切电泳模拟图

附录九:Peno-tktA 测序结果

附录十:pZB1-Peno-tktA 物理图谱及其酶切电泳模拟图

致谢

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