植物青枯菌群体猝灭基因的功能研究及利用

论文摘要

植物细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种世界性重大病害。青枯菌的寄主范围非常广泛,涉及50多个科的200种植物,其中包括马铃薯、番茄、茄子、辣椒、甘薯、花生、烟草、香蕉、桑树、桉树、油橄榄等许多重要的粮食、蔬菜及经济作物。植物病原细菌毒性基因的表达受群体感应（quorum-sensing）信号分子-AHL（酰基高丝氨酸内酯,N-acyl homoserine lactone）的调控,降解细菌产生的AHL信号分子,猝灭其群体感应,能够降低细菌的致病力。1.青枯菌aac基因的克隆及原核表达产物的功能分析克隆了青枯菌的aac（aculeacin A acylase）基因,构建了aac基因的原核表达载体,获得了AAC融合蛋白,证实了AAC蛋白能够降解细菌的AHL信号分子,猝灭细菌的群体感应,明显减弱病菌的致病力。2.青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性分析为明确aac基因在青枯菌致病过程中的作用,构建了aac基因重组自杀质粒,并将其电转化至青枯菌野生型菌株中,经过体内同源重组,获得了aac基因插入突变株。接种番茄的结果显示,aac突变株的致病性较野生型明显下降,证明了aac基因在青枯菌致病过程中起重要作用。3.抗青枯病转aac基因烟草和番茄的培育为进一步研究aac基因的功能,构建了aac基因高效植物表达载体pBI121-Ω4A-aac,转化至农杆菌,应用叶盘法分别转化至烟草和番茄。经过愈伤诱导及卡那霉素（Kan）筛选,分别获得了35株转基因烟草和15株转基因番茄。经过PCR、RT-PCR、Southern、ELISA检测,表明aac基因已经成功整合到转基因植株的基因组中,并得到正确的表达。接种青枯菌结果显示,转aac基因烟草和番茄的抗病性明显的增强,提高2-2.9个抗性级别,评价为中等抗病水平,表现为发病时间延迟,病情指数的降低。证明将青枯菌群体猝灭基因导入植物,是提高植物对青枯病抗性的有效策略。4.青枯菌毒性蛋白分泌系统Gsp蛋白互作分析为验证群体感应调控下与青枯菌毒性蛋白分泌相关的II型分泌系统Gsp蛋白间的互作,将青枯菌gspC、E、M、L基因克隆至不同的原核表达载体中,表达成Gsp C、E、M、L融合蛋白。通过包涵体蛋白变复性研究,获得了具有活性的复性后蛋白质。蛋白质体外结合试验（Pull-down）结果显示,GspE和GspL,GspL和GspM蛋白之间可发生相互作用。利用体外蛋白结合技术进一步验证了Gsp蛋白互作的真实性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 植物细菌性青枯病
• 1.1.1 植物细菌性青枯病的危害
• 1.1.2 青枯菌的致病过程
• 1.1.3 青枯菌的毒性因子及分泌
• 1.1.4 青枯菌致病基因表达的信号调控
• 1.2 植物病原细菌的群体感应及其调节机制
• 1.2.1 植物病原细菌的群体感应
• 1.2.2 植物病原细菌的信号分子
• 1.2.3 植物病原细菌的群体感应调节机制
• 1.2.4 重要植物病原细菌群体感应调控致病性的机制
• 1.3 植物病原细菌的群体猝灭
• 1.3.1 阻断AHL信号分子的合成
• 1.3.2 AHL的类似物作为拮抗物
• 1.3.3 AHL信号分子的酶解
• 1.4 植物病原细菌群体猝灭的利用
• 1.4.1 转基因植物产生AHL信号分子
• 1.4.2 生防菌提高植物的抗病性
• 1.4.3 AHL-内酯酶转基因植物的培育
• 1.5 本研究的目的意义和技术路线
• 1.5.1 研究的目的和意义
• 1.5.2 技术路线
• 第二章 青枯菌aac基因的克隆及原核表达产物的功能分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 生化试剂
• 2.1.3 培养基和菌株培养条件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 青枯菌基因组DNA的制备
• 2.2.2 高GC含量aac基因PCR扩增条件的优化
• 2.2.3 aac基因的制备
• 2.2.4 pET-5a载体双酶切的制备
• 2.2.5 pET-aac原核表达载体的构建
• 2.2.6 重组质粒的提取与酶切鉴定
• 2.2.7 目的蛋白的表达及检测
• 2.2.8 原核表达条件优化
• 2.2.9 AAC蛋白对病菌的致病作用的影响
• 2.2.10 AAC蛋白降解OHHL活性的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 青枯菌基因组DNA的制备
• 2.3.2 高GC 含量aac基因的PCR扩增条件的优化
• 2.3.3 aac基因原核表达载体的构建及序列分析
• 2.3.4 aac基因的诱导表达
• 2.3.5 原核表达条件优化
• 2.3.6 AAC融合蛋白活性测定
• 2.3.7 AAC融合蛋白降解OHHL活性的测定
• 2.4 讨论
• 第三章 青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 1245-1768 基因片段PCR扩增'>3.2.1 aac_1245-1768基因片段PCR扩增
• 3.2.2 庆大霉素基因的PCR扩增
• 3.2.3 aac基因重组自杀质粒pDS-aac’-Gm的构建及鉴定
• 3.2.4 青枯菌GMI 1000 感受态细胞的制备及电转化
• 3.2.5 aac基因突变菌株的筛选与鉴定
• 3.2.6 突变菌株和野生型菌株致病性的测定
• 3.3 结果与分析
• 1245-1768 基因片段的克隆'>3.3.1 aac_1245-1768基因片段的克隆
• 3.3.2 庆大霉素基因的克隆及重组质粒pGEM-aac’::Gm的构建及鉴定
• 3.3.3 自杀质粒pDS-aac’-Gm的构建及鉴定
• 3.3.4 aac基因突变菌株的筛选与鉴定
• 3.3.5 突变菌株和野生型菌株致病性的测定
• 3.4 讨论
• 第四章 抗青枯病转aac基因烟草和番茄的培育
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 植物材料
• 4.1.3 生化试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 高效植物表达载体的构建
• 4.2.2 农杆菌介导的叶盘法转化烟草
• 4.2.3 番茄离体再生体系的建立及优化
• 4.2.4 农杆菌介导的叶盘法转化番茄
• 4.2.5 转化植株的分子检测
• 4.2.6 转基因烟草的抗病性分析
• 4.3 结果和分析
• 4.3.1 高效植物表达载体的构建
• 4.3.2 烟草转化植株的获得
• 4.3.3 番茄再生体系的建立及优化
• 4.3.4 番茄转化植株的获得
• 4.3.5 转基因烟草的分子检测
• 4.3.6 转基因番茄的分子检测
• 4.3.7 转基因烟草的抗病性检测
• 4.3.8 转基因番茄的抗病性检测
• 4.4 讨论
• 第五章 青枯菌毒性蛋白分泌系统Gsp蛋白互作分析
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 生化试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 gspC、E、L、M基因原核表达载体的构建
• 5.2.2 目的蛋白的表达及检测
• 5.2.3 原核表达条件优化
• 5.2.4 蛋白质疏水性和跨膜区分析
• 5.2.5 包涵体的表达和初步纯化
• 5.2.6 透析复性法
• 5.2.7 CA refolding 试剂盒复性
• 5.2.8 氧化稀释复性及超滤浓缩蛋白法
• 5.2.9 融合蛋白质的纯化
• 5.2.10 6×His-GspL包涵体蛋白的柱上复性
• 5.2.11 体外沉降试验
• 5.2.12 Western Blot 方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 gspC、E、L、M基因原核表达载体的构建
• 5.3.2 目的蛋白的表达
• 5.3.3 原核表达条件的优化
• 5.3.4 Gsp 蛋白疏水性分析及跨膜区分析
• 5.3.5 包涵体的初步纯化
• 5.3.6 蛋白的复性
• 5.3.7 融合蛋白的纯化
• 5.3.8 柱上复性
• 5.3.9 Pull-down蛋白结合
• 5.4 讨论
• 第六章 全文结论
• 本研究得到以下结论
• 下一步工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历