论文摘要
产气肠杆菌属于肠杆菌科之肠杆菌属,是院内获得性感染的重要病原菌之一,可引起肺炎、心内膜炎、皮肤软组织感染、腹腔感染、关节炎、骨髓炎、尿路感染和菌血症等。近年来产气肠杆菌引起的医院感染逐年增加,由于不少感染菌株同时产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和头孢菌素酶（AmpC）,因而对大多数β-内酰胺类抗菌药物存在耐药性,仅对碳青霉烯类抗菌药物仍维持较高的敏感性。碳青霉烯类抗菌药物对极大多数由质粒或染色体介导的β-内酰胺酶都有较高的稳定性,与青霉素结合蛋白（PBPs）亲和力强,导致细菌细胞的延长和溶解,能有效渗透细菌外膜进入周质间隙,并且存在抗菌药物后效应,是目前所使用的抗菌药物中抗菌谱最广,抗菌活性最强,具有快速杀菌作用的一类抗菌药物。随着碳青霉烯类抗菌药物临床应用的增加,亚胺培南耐药的产气肠杆菌陆续被分离,给临床治疗造成困难,引起广泛重视。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的机制主要有三种:一、碳青霉烯酶的产生;二、药物作用靶位的改变;三、外膜蛋白（outer member protein）的缺失或数量的减少伴有质粒或染色体介导高水平β-内酰胺酶的持续产生。碳青霉烯酶分为A类、B类和D类,目前仅A类碳青霉烯酶KPC-2和B类碳青霉烯酶IMP-1-like,IMP-1,VIM-2在产气肠杆菌中有报道;碳青霉烯类抗菌药物能与革兰阴性菌的PBP1和PBP2结合,如PBP发生改变抗菌药物不能结合或亲和力下降,则产生耐药,目前全世界仅发现1株产气肠杆菌由于PBP2a的改变造成亚胺培南耐药;对革兰阴性菌而言,外膜通透性对药物进出菌体至关重要。膜上有亲水性的药物通道蛋白称外膜蛋白,主要有两种,分子量较大的为OmpF,分子量较小的为OmpC,外膜蛋白的缺失或数量的减少均可以导致细菌耐药性的发生。产气肠杆菌对亚胺培南的耐药主要由于Omp36的减少或缺失伴有ESBLs和或AmpC的产生引起。Omp36属于OmpC类蛋白家族,为跨膜通道蛋白,暴露于细胞表面,占据着膜孔。已有报道,Omp36的表达水平的调节与OmpX的调节级联密切相关,从而使决定孔蛋白通道直径的保守环Loop 3的电势平衡发生改变,进而造成亚胺培南不能进入细胞内。为明确我国亚胺培南耐药的产气肠杆菌的耐药机制,本研究分析了临床分离到的产气肠杆菌的克隆相关性、耐药性、耐药基因、耐药传播机制,为亚胺培南耐药的产气肠杆菌感染的防治提供基础。深入了解产气肠杆菌的耐药机制和耐药性的传递特性,对于指导临床合理使用抗菌药物和防止耐药株的流行有着重要的意义。1.亚胺培南耐药的产气肠杆菌耐药性研究收集2005年1月～3月我院一位肝移植术后患者分离到的4株产气肠杆菌,C1、C3分离自腹水,C2、C4分离自血液,其中C3、C4是在患者使用亚胺培南和美罗培南治疗40天后分离到。脉冲凝胶电泳（PFGE）结果表明,4株试验菌株酶切条带完全一致,均来自同一克隆株。4株产气肠杆菌对头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星及青霉素复合制剂哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸均耐药;对多粘菌素B、多粘菌素E和替加环素均敏感;C1、C2对亚胺培南、美罗培南敏感,而C3、C4对亚胺培南耐药、美罗培南中介。接合菌株对亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶敏感;对除头孢他啶外的三代头孢菌素和含β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂、阿米卡星、庆大霉素均耐药,对替卡西林/克拉维酸的耐药性降低。PCR证实4株产气肠杆菌TEM-1、CTX-M-3、CTX-M-14、SHV-12和DHA-1基因阳性,未检测到碳青霉烯酶基因。TEM-1、CTX-M-3和DHA-1β-内酰胺酶可通过肉汤接合进行转移。Western blot显示C1、C2表达OmpE36蛋白,而C3、C4不表达OmpE36蛋白。PCR扩增C3、C4的ompE36基因发现,在结构基因的97 bp后,IS903-like插入其中,引起ompE36基因的移码框改变,从而使OmpE36蛋白缺失。通过基因敲除菌株C1中的ompE36基因可导致亚胺培南、美罗培南的MIC值升高32倍,说明OmpE36在亚胺培南耐药中起着重要的作用。2.ompE36基因在大肠杆菌中的克隆和表达根据已发表的产气肠杆菌omp36基因序列（GenBank登录号AF335467）设计引物,对C1进行PCR扩增,获得了长度为1110 bp片段,经测序及BlastN比对发现与omp36基因高度同源（核苷酸同源性为95%,氨基酸同源性为89%）新的孔蛋白编码基因ompE36（GenBank登录号EF191076）。将其克隆到原核表达载体pQE30,与组氨酸（His）标签融合表达。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后△OmpE36融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,表达量达到22.3%。经Western blot检测也表明,表达的融合蛋白能与His单抗特异地反应。3.△OmpE36蛋白的纯化及兔抗OmpE36多克隆抗体的制备在大肠杆菌中表达的△OmpE36蛋白主要以包涵体形式存在,经过尿素变性,用镍琼脂凝胶柱将其纯化,通过Millipore中分子量蛋白超滤管浓缩OmpE36蛋白,得到了纯度为93%、浓度为3.3 mg/mL的重组蛋白。并以该浓缩液与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫家兔,制备了兔抗OmpE36多克隆抗体,经琼脂糖扩散试验测定其效价为1:32。提纯的OmpE36蛋白及制备的多抗为下一步用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体的效价提供基础。4.间接ELISA法检测兔抗OmpE36多克隆抗体效价用表达的纯化的重组OmpE36蛋白抗原包被ELISA板,利用制备的兔抗OmpE36多克隆抗体与该抗原结合,并对最适包被浓度、血清稀释度、最适封闭液、最佳显色时间进行了试验。获得的OmpE36抗体的效价为1:400。以上研究表明:1.我院临床分离的产气肠杆菌对亚胺培南耐药是由于产多种β-内酰胺酶（TEM-1、SHV-12、CTX-M-3、CTX-M-14和DHA-1）并伴有OmpE36孔蛋白的缺失所致。2.脉冲凝胶电泳分析,4株产气肠杆菌来自同一克隆株,提示在使用碳青霉烯类抗菌药物治疗感染的同时,也增加了细菌对其耐药的机会。3.新的孔蛋白编码基因ompE36基因（GenBank登录号EF191076）与omp36基因高度同源（核苷酸同源性为95%,氨基酸同源性为89%）。4.通过基因敲除法证明OmpE36在亚胺培南的耐药中起着主要作用。5.获得了琼扩效价为1:32的兔抗OmpE36多抗,在此基础上用间接ELISA法进一步测定OmpE36抗体的效价为1:400,为研究肠杆菌科细菌OmpC的表达情况奠定了基础。