机械性创伤诱发小鼠心肌细胞凋亡机制的研究

论文摘要

研究背景:机械性创伤（Mechanical trauma, MT,如车祸引起的创伤性伤害）在世界上是一个重要的医疗和社会问题。众所周知,胸部MT可以直接引起心脏损伤（如心脏挫伤和血管撕裂）。然而,几个临床小组报道,即使没有直接的机械性心血管损害,钝性胸部MT也可以引起心肌梗死及心脏功能减退。这些结果强烈提示, MT除了即刻对心脏的直接损伤外,还可以引起一种继发性心脏伤害,其机制尚不清楚。越来越多的证据表明,心肌细胞的凋亡可以导致心脏功能不全。MT后即刻给予非选择性半胱天冬蛋白酶（Caspase）抑制剂,不仅可以阻断MT引起的心肌细胞凋亡,而且可以减轻MT后的心脏功能不全。这些结果表明MT引起心肌细胞凋亡,继之可引起MT后的心脏功能不全。然而,MT导致MT后心肌细胞凋亡的病理性介质的来源和作用机制仍不清楚。辨明MT后心脏功能不全的发病机制,寻找阻止MT后继发性心脏损害的治疗策略,对于减少所有MT相关的器官损害至关重要。研究目的:1、确定MT引起心肌细胞凋亡的病理性介质的来源,源于创伤性心肌细胞（TCs）还是创伤性血浆（TP）;2、找出MT引起心肌细胞凋亡的主要病理性介质;3、阐明MT通过病理性介质触发心肌细胞凋亡的细胞内信号通路,以期搞清病理性介质、细胞凋亡与氧化/硝化应激的关系。研究方法:1、制备小鼠非致命性机械性MT模型。麻醉小鼠后,将其置于Noble-Collip鼓（直径12英寸）,以40 rpm的转速,旋转200圈,造成小鼠非致命性MT伤害。2、为了确定MT后引起心肌细胞凋亡的病理性介质来源于TCs还是TP,分别分离MT组小鼠心肌细胞（TCs）和对照组小鼠心肌细胞（NCs）,并分别用含有10%的TP （从MT后1.5 h不同小鼠得到）或正常小鼠血浆（NP）的培养液培养12 h。3、为了辨明MT后触发心肌细胞凋亡的病理性介质,分离MT小鼠心肌细胞,并分别与下列因子一起培养12 h:1) NP; 2) TP; 3)干扰素（IFN- ）、白细胞介素1 （IL-1 ）和肿瘤坏死因子α（TNF- ）的混合物; 4)分别填加细胞因子混合物中的单一成分;5) TP和抗TNF-抗体; 6) TNF-基因敲除鼠的TP。4、为了阐明氧化/硝化应激在MT触发的心肌细胞凋亡中的作用,分离MT小鼠心肌细胞,分别给予下列之一处理并培养细胞12 h:1) NP; 2) TP; 3) TP和1400W （一种高度选择性iNOS抑制剂）; 4) TP和apocynin （一种NADPH氧化酶抑制剂）;或5) TP和FP15 （一种ONOO-分解催化剂）。5、给予野生型小鼠MT处理后,在体分别给予溶剂、etanercept（一种TNF-拮抗剂）、1400W、apocynin和FP15 ;给予TNF-基因敲除（TNFα-/-）鼠MT处理,不做任何其他处理。将小鼠于MT 12 h后处死。6、使用相应酶联免疫吸附法（ELISA）分析试剂盒测定血浆IFN-、IL-1和TNF-浓度。7、通过检测caspase-3活性、ELISA法测定核小体或末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记术（TUNEL）染色确定心肌细胞的凋亡情况。8、使用光泽精加强发光法检测心肌。O2-的产生量。9、使用ELISA法检测心肌细胞硝基酪氨酸（一种在体ONOO-印迹）的含量。10、使用蛋白质印迹（Western blot）法检测心肌gp91phox（NADPH氧化酶的一种主要成分）和iNOS含量。11、使用化学发光NO探测仪检测NOX （NO及其代谢产物NO2和NO3的统称）含量。研究结果:1、将TP加到TCs培养液中,引起caspase-3活性的升高（NC+NP组的2.18±0.24倍, P <0.01, n=9）。而将TCs与NP一起培养,未观察到caspase-3活性显著性改变（NC+NP组的1.13±0.09倍,P>0.05, n=10）。然而,将TP加到NCs培养液中,观察到caspase-3活性的升高（NC+NP组的1.88±0.18倍,P <0.01, n=9）。这一结果证实,MT引起心肌细胞凋亡的病理性介质存在于TP,而非TCs自身及NP中。2、虽然MT后,血浆中不同的细胞因子表现出不同的时间曲线的变化,但与对照组比较,创伤动物IL-1、IFN-、和TNF-的血浆水平均显著性升高（2.19±0.16 vs. 1.11±0.02 pg/mg蛋白, 1.22±0.14 vs. 0.68±0.02 pg/mg蛋白, 0.48±0.02 vs. 0.19±0.01 pg/mg蛋白, P <0.01, n=7-9）。值得注意的是,所有这三个细胞因子达到高峰的时间均早于文献所述的MT后心肌细胞凋亡发生的时间点,即在或早于MT后1.5h。3、将NP和细胞因子混合物与TCs一起培养,导致caspase-3活性的升高（NP组的1.71±0.18倍, P <0.01, n=9）,升高程度与使用TP处理心肌细胞所观察到的相似,提示这些细胞因子在TP引起的心肌细胞凋亡中发挥作用。4、与NP组比较,单独填加IFN-或IL-1 ,对caspase-3活性无明显影响（NP组的0.88±0.15和1.11±0.12倍, P >0.05, n=7-9）。然而,以细胞因子混合物中的使用浓度,单独填加TNF-显著性增加了caspase-3活性（NP组的1.64±0.14倍, P <0.01, n=9）,提示TNF-是细胞因子混合物中引起心肌细胞凋亡的细胞因子。5、使用抗TNF-抗体中和TNF- ,几乎完全阻断了TP引起的心肌细胞caspase-3的激活（1.13±0.17 vs. 1.88±0.18 NP组的倍数,P < 0.01, n=7）。与野生型小鼠TP比较,填加TNF-–/–小鼠的TP不能引起显著性caspase-3的激活（1.10±0.19 vs. 1.88±0.18 NP组的倍数,P < 0.01, n=9）。这些结果证明存在于TP中的TNF-是TP引起心肌细胞凋亡首要因素。6、与NP组比较,使用TP处理心肌细胞,iNOS和gp91phox蛋白表达显著性上调（NP组的2.44±0.42倍和NP组的1.63±0.18倍,P < 0.01, n=7-9）,NO和。O2-产生显著性增多（NP组的2.37±0.31倍和NP组的1.54±0.17倍,P < 0.01, n=7-9）,ONOO-的产生也显著性增加（8.02±1.23 vs. 1.87±0.25 nmol/g蛋白, P < 0.01, n=7-9）。更重要的是,使用抗TNF-抗体中和TNF-几乎完全阻断了TP引起的氧化/硝化应激,与溶剂组相比,iNOS和gp91phox蛋白的显著性表达被抑制（1.34±0.32 vs. 2.44±0.42 NP组的倍数, 1.15±0.10 vs. 1.63±0.18 NP组的倍数,P < 0.01, n=7-9）,NO和。O2-产生明显减少（1.32±0.12 vs. 2.37±0.30 NP组的倍数, 1.11±0.09 vs. 1.54±0.17 NP组的倍数,P < 0.01, n=7-9）,ONOO-的产生也显著性减少（2.77±0.72 vs. 8.02±1.23 nmol/g蛋白,P < 0.01, n=7-9）。这些结果提供了明确的证据,即存在于TP中的TNF-是引起TCs显著氧化/硝化应激的首要因素。7、与TP组比较,使用1400W显著性减少了置于TP的心肌细胞的NO产生量（1.04±0.13 vs 2.26±0.11 NP组的倍数, P < 0.01, n=10）,而未影响。O2-的产生量（1.42±0.07 vs. 1.62±0.15 NP组的倍数, P >0.05, n=10）。相反,使用apocynin显著性减少了。O2-的产生量（1.04±0.05 vs.1.62±0.15 NP组的倍数, P < 0.01, n=10）,而未影响NO的产生量（2.20±0.19 vs. 2.26±0.11 NP组的倍数, P >0.05, n=10）。使用FP15既未影响NO（2.16±0.18 vs.2.26±0.11 NP组的倍数, P >0.05, n=9）,也未影响。O2-的产生量（1.40±0.06 vs.1.62±0.15 NP组的倍数, P >0.05, n=9）。然而,所有三种处理均显著性减少了ONOO-的产生量（2.61±0.35, 3.06±0.55, 1.55±0.33 vs. 8.09±1.28 nmol/g蛋白, P < 0.01, n=11）,并且减少了TP引起的caspase-3激活（1.24±0.16, 1.05±0.10, 1.01±0.14 vs. 1.91±0.14 NP组的倍数, P < 0.01, n=10）。这些结果表明TNF-触发的氧化/硝基化应激在TP引起的心肌细胞凋亡中发挥着极重要的作用。8、在体实验,与对照组比较,MT导致野生型小鼠显著性心肌细胞凋亡,表现为TUNEL阳性细胞增多（8.37±0.57 vs. 0.32±0.09% ,P < 0.01, n=10）和caspase-3活性升高（是对照组2.9±0.2倍, P < 0.01, n=10）。使用etanercept明显减少了MT后心肌细胞TUNEL阳性染色率（ 1.2±0.14% vs. 8.37±0.57%, P < 0.01,n=10）和降低caspase-3活性（1.5±0.45 vs. 2.9±0.2对照组的倍数, P < 0.01, n=10）。给人留下深刻印象的是,与野生型MT小鼠比较,在TNF-α基因敲除MT小鼠,几乎无TUNEL阳性细胞（0.8±0.19% vs. 8.37±0.57%, P < 0.01 , n=10）和caspase-3激活（1.4±0.16 vs. 2.9±0.2对照组的倍数,P < 0.01, n=10）。9、与对照组比较,野生型小鼠MT处理后,iNOS （29,610±5,093 vs. 1,938±717 AU , P < 0.01 , n=10）和gp91phox （104,317±4,361 vs. 10,619±1,522 AU , P < 0.01,n=10）的蛋白表达上调,NO （ 9.9±0.7 vs. 7.1±0.4μmol/g蛋白, P < 0.01,n=10）和。O2（-273±13.9 vs. 153±8.3 RLU/mg组织, P < 0.01, n=10）产生增加,并且蛋白质硝基化明显增加（2.86±0.09 vs. 1.67±0.05 nmol/g蛋白, P < 0.01, n=10）。然而,与溶剂组比较,在体使用etanercept或TNF-基因敲除处理,降低iNOS蛋白表达（3,380±1,053,2,512±1,154 vs. 29,610±5,093 AU, P < 0.01 , n=10）和NO的产生量（7.04±0.56,7.44±0.32 vs. 9.9±0.7μmol/g蛋白, P < 0.01, n=10）,减少gp91phox蛋白表达（26,478±4,361, 6861±2,239 vs. 104,317±4,361 AU, P < 0.01 , n=10）和。O2-的产生（163.1±12.70, 146.1±22.18 vs. 273.2±14.93 RLU/mg组织, P < 0.01, n=10）,并且减少了蛋白质硝基化（2.09±0.12, 1.54±0.19 vs. 2.86±0.08 nmol/g蛋白, P < 0.01 , n=10）。10、在体实验,与溶剂组比较,使用1400W/apocynin阻断iNOS/NADPH氧化酶的活性,或使用FP15增加ONOO-的分解,明显地减少了TUNEL染色数（2.50±0.49、1.51±0.28和1.62±0.12% vs. 8.23±0.48% P < 0.01 , n=9-11）和caspase-3的激活（1.63±0.14、1.29±0.09和1.05±0.10 vs. 2.05±0.15空白对照组的倍数, P < 0.05或P < 0.01 , n=9-11）,显示出MT后心肌细胞的凋亡减少。研究结论:1.本研究首次揭示触发MT心肌细胞凋亡的病理性介质存在于TP,而非TCs自身;2.本研究首次证实TP中过多产生的TNF- ,是非致命性MT引起心肌细胞凋亡最主要的病理性介质;3.本研究首次阐明MT后经TNF-触发、通过心肌细胞iNOS和NADPH氧化酶依赖和ONOO-介导的信号通路导致心肌细胞凋亡。该研究为从分子水平阐明MT诱发心肌细胞凋亡的机制提供了实验依据,为临床防治MT后心肌细胞凋亡提供了新的治疗策略。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历
• 攻读博士学位期间发表及完成的学术论文
• 致谢