论文摘要
心肌肌钙蛋白Ⅰ自身抗体心肌损伤作用的初步研究背景：急性心肌梗死、高血压心脏病、病毒性心肌炎、原发性心肌病等疾病，最终可表现为心力衰竭，其本质是心肌损伤。基因变异、病毒感染、急慢性心肌缺血等因素可引起心肌病变和损伤、影响心脏功能。在心肌损伤过程中，基因变异导致心肌蛋白质表达的改变、病毒分子与心脏蛋白质具有相似的抗原决定簇、缺血或其他引起心肌组织坏死的原因导致胞内蛋白质释放等因素可激活免疫系统，产生自身抗体。自身免疫的重要特征是自身抗体表达水平的增高，目前已在多种心脏疾病如扩张型心肌病、病毒性心肌炎、心肌梗死等患者血清中发现心脏自身抗体增高，包括抗肾上腺素能受体抗体、抗肌球蛋白抗体、抗胆碱能受体抗体等。临床研究发现，心脏自身抗体增高的患者在接受免疫吸附治疗后，其心功能可得到改善。有学者提出自身抗体可能通过直接或间接途径造成心肌损伤、心功能损害。心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）是心脏特异性蛋白质，心肌损伤后释放入血，可激活免疫系统产生cTnI自身抗体，后者长期存在于患者血清中。有文献报道，在心肌梗死患者血清中可检测到cTnI自身抗体，但其作用尚未阐明。在动物实验中，cTnI抗体可慢性激活心肌细胞膜L型钙通道，细胞内钙离子浓度增高，提示cTnI抗体可能具有心肌损伤作用。但心肌梗死患者血清中cTnI自身抗体是否具有心肌损伤的病理作用、是否与患者预后相关，有待进一步研究。目的：建立血清cTnI自身抗体的检测方法，观察心肌梗死患者血清cTnI自身抗体水平及其与临床预后的关系；以抗人cTnI单克隆抗体干预培养乳鼠心肌细胞，初步探讨cTnI自身抗体的病理作用。方法：1．收集38例心肌梗死患者血清标本，所有患者均参照中华医学会心血管病分会2001年心肌梗死诊断及治疗指南明确诊断。收集38例健康体检者血清作为对照。2．以人cTnI为抗原包被微孔板，以鼠抗人IgG为第二抗体，建立检测血清cTnI自身抗体的间接ELISA方法。通过检测不同浓度抗人cTnI抗体，验证此法灵敏度。检测心肌梗死患者及健康体检者血清cTnI自身抗体，以超过对照组（?）±3SD为阳性。3．对心肌梗死患者进行随访，平均3个月。观察再发心肌梗死事件。4．体外培养乳鼠心肌细胞，以抗人cTnI单克隆抗体（10μg／ml、50μg／ml）、鼠IgG（50μg／ml）、抗体稀释液（0.2M PBS，0.15M NaCl，0.03％NaN3，pH7.4）干预48小时，观察乳鼠心肌细胞形态、生长密度、搏动率以及培养液上清的变化。心肌细胞损伤的生物指标检测，观察cTnI单克隆抗体干预48小时后乳鼠心肌细胞培养上清CK-MB水平。5．以抗人cTnI单克隆抗体作为一抗、碱性磷酸酶（ALP）标记的羊抗鼠IgG及异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠IgG作为二抗，分别进行免疫组化及免疫荧光检测，确定抗人cTnI单克隆抗体是否与培养乳鼠心肌细胞结合。结果：1．38例心肌梗死病例为南京医科大学第一附属医院住院患者，男28例，女10例，年龄50～79岁，平均年龄68.3±7.9岁，临床诊断由18导心电图、血清学检查及冠状动脉造影证实为急性心肌梗死；对照组为门诊健康体检者，男28例，女10例，年龄55～78岁，平均年龄67.9±6.3岁。2．建立的间接ELISA方法，用不同浓度鼠抗人cTnI单克隆抗体作为标本检测，可检出0.54ng／ml以上浓度的cTnI单克隆抗体。心肌梗死患者组血清cTnI自身抗体检测平均水平为0.732±0.258，对照组检测平均水平0.531±0.135，38例心肌梗死患者中检出cTnI自身抗体阳性8例，阳性率21％；对照组无cTnI自身抗体阳性。3．心肌梗死患者出院后随访三个月内，8例cTnI自身抗体阳性患者中死亡1例，再发心肌梗死1例；其他cTnI自身抗体阴性患者无再发心肌梗死。4．以抗人cTnI单克隆抗体（10μg／ml、50μg／ml）干预48小时，乳鼠心肌细胞密度减少，有细胞碎片。细胞搏动率下降，与cTnI单克隆抗体浓度呈负相关。应用干预48小时后，50μg／ml、10μg／ml抗人cTnI单克隆抗体组细胞搏动数较干预前分别降低60％、39％。培养液上清颜色随cTnI抗体浓度的增加及培养时间增加而变黄（pH值降低）。鼠IgG干预组与抗体稀释液组、DMEM组结果相近，心肌细胞体积增大，细胞密度增加，搏动数与干预前无明显改变。以50μg／ml抗人cTnI单克隆抗体干预48小时后，培养细胞上清中CK-MB检测值为30.3±6.4（U／L），高于10μg／ml抗人cTnI单克隆抗体干预组（18.6±2.6 U／L），高于抗体稀释液干预组（4.4±0.4 U／L）、DMED培养组（4.7±0.5 U／L）。50μg／ml鼠IgG组（5.3±0.4 U／L）与抗体稀释液组、DMEM组检测结果相近。5．应用免疫组化分析，未干预的乳鼠心肌细胞与抗人cTnI单克隆抗体反应1小时后，ALP标记的羊抗鼠IgG，可在显色剂作用后呈现细胞着色反应。以抗人cTnI单克隆抗体干预后的乳鼠心肌细胞，直接加入ALP标记的羊抗鼠IgG，在显色剂作用后亦可见细胞着色反应。应用免疫荧光检测分析，以鼠抗人cTnI干预的乳鼠心肌细胞，加入FITC标记的羊抗鼠IgG后，心肌细胞可见明显荧光。结论：1．本论文建立了人血清cTnI自身抗体检测的ELISA方法，可在心肌梗死患者血清中检出cTnI自身抗体。心肌梗死患者血清cTnI自身抗体水平的增高，可能与患者预后不良有关。2．抗人cTnI单克隆抗体对于培养乳鼠心肌细胞有损伤作用。