前列腺癌血清miRNAs表达谱的检测和miR-101靶向EZH2调控作用的初步研究

论文摘要

前列腺癌（prostatecancer,PCa）是男性最常见的泌尿系恶性肿瘤之一。目前主要的治疗方法有:根治性手术治疗和内分泌治疗、放射治疗及化疗等。根治术后局部复发或远处转移及许多无手术机会的患者,常选用内分泌治疗。接受内分泌治疗的患者,大多数起初有效,但几乎都将逐渐发展为激素非依赖性前列腺癌或激素难治性前列腺癌,激素治疗将不再有效。因此,揭示前列腺癌进展中的分子机制已成为国内外研究的热点。微小RNA（microRNA,miRNA,miR）是一类长度约21～25nt的非编码RNA,它通过影响mRNA的翻译和稳定性,在转录后水平发挥靶基因内源性抑制因子的作用。在过去的几年中,各种人类肿瘤的miRNA表达谱分析提示许多miRNA发挥着抑癌基因的作用。相对于正常组织而言,miR-101在多种恶性肿瘤中表达下调,目前认为miR-101可能作为一个恶性肿瘤治疗性干预的潜在靶点。本研究中我们首先检测不同临床阶段前列腺癌患者的血清和前列腺增生患者的血清中差异性的miRNAs表达谱,筛选与前列腺癌相关的miRNA。探索血清中miR-101能否有利于前列腺癌的诊断和评估其恶性程度。此外,我们利用人工合成的miR-101模拟物（miR-101 mimics）转染前列腺癌PC-3细胞,从而分析在前列腺癌中miR-101与EZH2的靶向调节效应和作用机制。本研究分两个部分:第一部分前列腺癌患者血清miRNAs表达谱的研究目的:研究不同临床阶段前列腺癌患者的血清和前列腺增生患者的血清中差异性表达的miRNAs谱,筛选与前列腺癌相关的miRNA。方法:采用miRNA芯片技术（miRNA microarray）筛选激素依赖性前列腺癌（androgen-dependent prostate cancer,ADPC）、激素非依赖性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer,AIPC）和前列腺增生（benign prostatic hyperplasia,BPH）患者血清中差异表达的miRNA,并对数据库中获取的表达差异的miRNA所调控的靶基因功能进行GO分析和pathway分析。结果:对3例ADPC、3例AIPC和3例前列腺增生患者的血清进行了 miRNA芯片分析,共筛选出31个差异表达的miRNA;ADPC组与BPH组血清相比,有8个miRNA表达存在差异,其中有7个miRNA表达上调（miR-181a-2、miR-29a、miR-423-5p、miR-424、miR-1184、miR-671-3p、miR-548b-3p）,1 个 miRNA 表达下调（let-7b）（P<0.001）;AIPC组与BPH组血清相比,有9个miRNA表达上调（miR-181a-2、miR-3664、miR-519e、miR-144、miR-603、miR-187、miR-491-3p、miR-BART20-5p、miR-3139）,有 6 个 miRNA 表达下调（miRPlus-A1073、miR-542-3p、miR-660、miR-134、miR-15b、miR-H4-3p）（P<0.001）;其中 miR-181a-2 在 ADPC组和AIPC组中均明显高表达;AIPC组与ADPC组血清相比,分别有4个miRNA表达上调和下调,其中上调的miRNA为miR-BART16、miR-3142、miR-491-3p、miR-214;下调的 miRNA 为 miR-369-3p、miR-371-3p、miR-495、miR-671-3p（P<0.001）。通过数据库分析得出异常表达miRNA调控的靶基因并进行Gene Ontology（GO）和Pathway的显著性分析,得到了相应的显著性的GOs和和Pathway。结论:miRNA可能参与了前列腺癌的发生发展和雄激素非依赖性的转变,血清中差异性表达的miRNA可能成为潜在的前列腺癌诊断和治疗的靶点,其中miR-181a-2可能与前列腺癌的发生发展有关。前列腺癌血清中未能检测到miR-101的差异表达,这证实血清和组织中miRNA的相关性仍存在争议。第二部分miR-101和EZH2在前列腺癌中的表达以及miR-101靶向EZH2对PC3细胞生物学行为的影响目的:通过检测前列腺癌及正常前列腺上皮细胞中miR-101和EZH2的表达水平,利用合成的miR-101 mimics转染前列腺癌PC-3细胞并观察对其生物学行为的影响,从而分析在前列腺癌中miR-101与EZH2的靶向调节效应和作用机制。方法:运用实时定量PCR（Real-time quantitative PCR）检测前列腺癌PC-3细胞、LNCaP细胞和前列腺正常上皮RWPE-1细胞中miR-101和EZH2 mRNA的表达;应用Western-Blot蛋白印记法检测上述细胞中EZH2的蛋白表达水平;PC-3细胞分为三组:不转染的空白对照组（B组）;转染NC的阴性对照组（NC组）;转染miR-101 mimics的实验组（miR-101组）。通过miR-101mimics转染前列腺癌PC-3细胞并上调细胞中miR-101的表达,Real-time qPCR和Western blot检测细胞中EZH2表达水平的变化;应用噻唑蓝比色法（MTT法）测定细胞增殖情况、流式细胞仪检测细胞周期;AnnexinV/PI双染色法测量细胞凋亡率;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力。对所有数据进行统计学分析。结果:（1）miR-101在PC-3细胞和LNCaP细胞中的表达明显低于RWPE-1细胞,miR-101在前列腺各细胞株间的表达具有显著差异性（P<0.05）。（2）EZH2 mRNA在PC-3细胞和LNCaP细胞中的表达明显高于RWPE-1细胞,EZH2蛋白在PC-3细胞和LNCaP细胞中的表达也明显高于RWPE-1细胞,EZH2mRNA和蛋白在前列腺各细胞株间的表达具有显著差异性（P均<0.05）。miR-101的表达量与EZH2表达量呈负相关趋势（P<0.05）。（3）miR-101 mimics转染PC-3细胞后,细胞中的miR-101表达上调（P<0.05）,而EZH2mRNA和蛋白表达水平也明显降低（P<0.05）。（4）MTT法检测结果显示:转染后48、72、96小时miR-101组细胞增殖明显低于B组和NC组（P<0.05）,两对照组无显著性差异（P>0.05）。（5）流式细胞仪测定结果显示:转染后48小时,miR-101组发生了 Go/G1期阻滞（P<0.05）,B组和NC组细胞周期分布无显著差异（P>O.05）。（6）细胞凋亡率检测结果显示:转染后48小时,B组、NC 组及 miR-101 组 PC-3 细胞凋亡率分别为:2.53±0.36%、2.71 ±0.42%、9.84±0.83%,miR-101组凋亡率明显高于两对照组（P<0.01）。（7）划痕实验检测结果显示:miR-101组细胞迁移能力明显低于对照组（P<0.01）;两对照组无显著性差异（P>0.05）。（8）Transwell侵袭实验结果显示:miR-101组穿过Matrigel凝胶的细胞数显著少于B组和NC组（P<0.01）,两对照组间无显著性差异（P>0.05）。结论:（1）前列腺癌细胞中miR-101表达量较正常前列腺细胞降低,而EZH2的表达量则上调;提示异常表达的miR-101和EZH2均参与了前列腺癌的发生发展;两者表达呈负相关提示EZH2可能是miR-101负向调控的靶基因之一。（2）miR-101在AIPC细胞中表达水平低于ADPC细胞,EZH2的表达则相反;提示两者可能在激素非依赖性转化过程中起着一定的作用。（3）miR-101丧失对EZH2表达的抑制导致EZH2异常高表达可能是前列腺癌发生的重要机制;在前列腺癌PC-3细胞中上调miR-101能够抑制EZH2的表达。（4）上调miR-101的表达能显著抑制PC-3细胞的增殖和促进其凋亡,还能够降低PC3细胞的迁移和侵袭能力。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 前列腺癌患者血清miRNAs表达谱的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 miR-101和EZH2在前列腺癌中的表达以及miR-101靶向EZH2对PC3细胞生物学行为的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 中英文缩略词表
• 攻读学位期间公开发表的论文和所获奖项
• 课题资助
• 致谢