鹦鹉热嗜衣原体禽鸟株的分离、鉴定与基因分型

论文摘要

目的：优化鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci，C.psittaci，Cps）禽鸟株分离鉴定培养技术，通过测序及进化树分析ompA基因的多态性，研究Cps的种系发育史及获得可靠Cps感染的流行病学资料，掌握衡阳地区Cps的流行病学特征，从而为Cps感染的预防、诊断、治疗措施提供依据。方法：收集衡阳地区可疑的禽鸟标本，利用分子生物学技术，提取禽鸟肝组织全基因组DNA，设计MOMP特异性引物，PCR扩增约264bp的基因片段，用1.7%琼脂糖凝胶电泳分离。将PCR阳性禽鸟标本肝组织匀浆液接种到单层敏感细胞株人喉癌上皮细胞（Hep-2）细胞和非洲绿猴肾细胞（Vero）中培养，免疫荧光染色法（IF）鉴定Cps包涵体，免疫荧光显微镜下观察两种细胞内包涵体形态的变化。按照文献设计另一对MOMP特异性引物，PCR扩增约1000bp的基因片段，用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，将阳性PCR产物进行纯化后送往测序公司进行测序，同时从Genebank中获得Cps各型参考株的ompA基因序列，利用软件ClustalX2和MEGA3构建系统进化树分析临床株与各参考株之间的亲缘关系。通过BLAST分析8例标本基因间的相似性。结果：通过PCR扩增及测序的方法从591例禽鸟标本（其中鹦鹉425只，鸽子23只及其它类型禽鸟143只）中检测到8例阳性，其中7例来源于鹦鹉，染率约为1.64%，1例来源于相思鸟。鸽子的染率为0%，其它类型禽鸟的染率约为0.69%；8例阳性标本在Hep-2及Vero细胞中成功培养出7株，成功率为87.5%；通过Cps在Hep-2细胞与Vero细胞中培养生长情况的比较，发现Hep-2细胞在原代培养时其胞内包涵体形成单位（IFU）数量大于Vero细胞，培养三代后免疫荧光染色发现，Vero细胞内的IFU数量较Hep-2细胞大；对8例阳性禽鸟标本PCR产物ompA基因序列进行测序，测序结果与Cps各型参考株ompA序列进行软件分析，系统进化树显示其中7例为A型，另外一例暂未能分型；将8例阳性禽鸟标本PCR产物ompA基因序列与C. psittaci6BC标准株ompA基因进行BLAST分析，Cps6BC与其中7例的相似度在92%～99%之间，另外一例与Cps6BC的相似度仅为58%；将E9的ompA基因与Genebank中其它已知菌株基因进行比对也未能对其进行确定。结论：（1）成功分离Cps禽鸟株7株，并完善了Cps阳性禽鸟株分离鉴定培养技术；（2）衡阳地区Cps可能主要以鹦鹉为其宿主，以基因型A为主要型别，且存在一定的变异。

论文目录

• 主要英文缩写词索引
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 文献综述
• 参考文献
• 研究成果及发表文章
• 致谢