提高花生α-维生素E含量的载体构建及其转化研究

论文摘要

花生（Arachis hypogaea L.）是世界上四大油料作物之一,在世界范围内的热带和亚热带地区都有种植。中国是世界上最大的花生生产国和消费国。维生素E是一种脂溶性的抗氧化剂,在人体、动物以及植物体内都有重要的生理作用。植物油是人类摄取维生素E的主要途径。植物包括花生在内具有高活性α-维生素E的含量非常低,为了提高花生中维生素E的含量,我们试图通过基因工程的办法改良现有的花生品种。本文报道维生素合成途径中的重要基因尿黑酸合成酶（VE2）基因、2-甲基6-植基-苯醌甲基转移酶（VE3）基因和γ-生育酚甲基转移酶（VE4）基因的克隆,种子特异表达启动子引导的植物表达载体构建,以及这些载体对花生进行遗传转化的研究结果。1、为了使维生素E相关的基因在花生胚中特异表达,通过PCR的方法在同源性分别为99.8%和100%的T载体中分离得到两个种子特异表达启动子。他们分别是大豆种子储藏蛋白启动子（7S）和油菜种子储藏蛋白启动子（2S）。这两个启动子的长度分别为795bp和1058bp。2、提取拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶子的总RNA,并根据GenBank所发表的VE2、VE3和VE4序列设计引物,通过RT-PCR的方法分离得到这3个基因,他们和GenBank上所发表的序列同源性分别为98%、100%和100%。把这三个基因分别构建到中间表达载体pSPROK中,并且在VE2基因的上游插入7S,在VE3和VE4基因上游分别插入2S,来调控这3个基因在种仁特异表达。然后从这3个载体中酶切出分别带有启动子、基因和终止子的完整表达单元,构建到植物表达载体pCAMBIA1300中,所构建成的植物表达载体分别命名为pCAMBIA1300VE2·7S、pCAMBIA1300VE3·2S和pCAMBIA1300VE4·2S。测序分析显示3个基因的完整表达单元成功构建在植物表达载体pCAMBIA1300中。3.为了更高效地改良花生中维生素E的合成效率,在单价载体的基础上构建了一个双价植物表达载体pCAMBIA1300 VE2·VE3,它含有VE2和VE3各自的启动子和终止子表达单元。为了同时改良花生中维生素E含量和油酸含量,亦构建得到双价植物表达载体pCAMBIA1300AT,它含有VE4的完整表达单元和FAD2的反义RNA表达单元。4、将pCAMBIA1300VE4·2S、pCAMBIA1300AT、pCAMBIA13002a等3个植物表达载体通过根癌农杆菌介导对花生进行遗传转化,提取抗性苗DNA进行PCR反应显示,他们的表达单元都已经插入到花生基因组中,各得到转基因苗3株、3株和6株,转化率分别为:2.00%、2.00%和3.85%。由于这些基因都是由种子特异表达启动子所引导,应待转基因苗种子收获后再作进一步检测。综上所述,本研究构建了5个植物种子特异表达载体用来提高花生得维生素E含量,并将pCAMBIA1300VE4·2S、pCAMBIA1300AT、pCAMBIA13002a等3个载体对花生进行了转化,得到了转基因植株,为改良花生维生素E和油酸含量奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 维生素E的结构、分类与活性
• 1.2 植物体内维生素E的终代谢途径
• 1.3 植物维生素E基因工程的研究进展
• 1.4 农杆菌介导的花生遗传转化研究进展
• 1.4.1 以农杆菌介导的遗传转化原理
• 1.4.2 花生植株再生体系研究进展
• 1.4.3 花生基因转化研究进展
• 1.5 本研究的主要内容与意义
• 第二章 维生素E关键酶基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.1.1 菌种与质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 所用引物
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 拟南芥材料培养及总RNA的提取
• 2、VE₃、Υ-TMT的克隆'>1.2.2 目的基因VE₂、VE₃、Υ-TMT的克隆
• 2.2 试验结果与分析
• 2.2.1 目的基因VE2、VE3、Υ-TMT的克隆结果
• 2.2.2 目的基因VE2、VE3、Υ-TMT的测序结果
• 2.3 讨论
• 第三章 维生素E植物特异表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 菌种与质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 所用引物
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 DNA片断的酶切反应
• 1.2.2 DNA酶切产物的连接反应
• 1.2.3 大肠杆菌感受态的制备和转化
• 1.2.4 重组子的菌落PCR
• 1.2.5 阳性克隆菌落培养和质粒的提取
• 1.2.6 DNA片断末端平滑化
• 1.2.7 质粒线性化后去磷酸化
• 1.2.8 根癌农杆菌感受态细胞的制备及植物表达载体根癌农杆菌的转化
• 2 试验结果
• 2.1 pCAMBIA1300 VE3-2S植物特异表达载体的构建
• 2.2 pCAMBIA1300 VE2-7S植物特异表达载体的构建
• 2.3 pCAMBIA1300 Υ-TMT-2S植物特异表达载体的构建
• 2.4 pcAMBIA1300 AT双价植物特异表达载体的构建
• 2.5 pCAMBIA1300 VE2-VE3双价植物特异表达载体的构建
• 2.6 植物表达载体转化农杆菌
• 3 讨论
• 3.1 种子特异表达启动子的应用
• 3.2 维生素E基因片断的克隆及分析
• 第四章 维生素E生物合成关键基因导入花生
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 菌株与质粒
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 工程菌液的制备
• 1.2.2 外植体的表面消毒
• 1.2.3 基因转化方法
• 1.2.4 植物基因组DNA的提取
• 1.2.5 抗性苗PCR分子鉴定
• 2 试验结果
• 2.1 共培养结果
• 2.2 丛生芽诱导结果
• 2.3 抗性芽筛选结果
• 2.4 抗性芽的伸长与生根结果
• 2.5 抗性植株PCR检测结果
• 3 讨论
• 3.1 抗性芽筛选的潮霉素（HYG）浓度确定
• 3.2 丛生芽诱导激素浓度的确定
• 3.3 后续工作
• 参考文献:
• 附录1:VE2基因的测序结果及载体pCAMBIA1300 VE2-7S的注释
• 附录2:VE3基因的测序结果及载体pCAMBIA1300 VE3-2S的注释
• 附录3:Υ-TMT基因的测序结果及载体pCAMBIA1300 Υ-TMT-2S的注释
• 附录4:载体pCAMBIA1300 VE2-VE3的序列及注释
• 附录5:载体pCAMBIA1300 AT的序列及注释
• 附录6:主要化学试剂及缓冲液配制
• 附录7:常用培养基配方
• 致谢