Smoothened（Smo）siRNA对结肠腺癌Lovo细胞Smo基因表达及细胞增殖与凋亡的影响

论文摘要

结直肠癌（colorectalcancer,CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一,严重危害着人类的健康与生命。目前认为,结直肠癌的发生是机体内因（结直肠癌的遗传易感性）和外因（饮食和环境因素）共同作用的结果。大量实验证明结直肠癌的发生与基因改变密切相关,正常粘膜细胞在生长、分化过程中出现癌基因的激活、抑癌基因的失活与丢失都可能导致结直肠癌的发生,其癌变过程可能涉及多个基因、多个位点的突变与丢失。通过对结直肠癌发生发展有关的基因研究,不仅可以进一步明确结直肠癌的发生机制,同时也为结直肠癌的生物治疗提供新的靶向。近年来,研究发现很多在胚胎发育、组织分化过程中起调控作用的信号通路同样在肿瘤发生的过程中发挥着重要的作用,其中包括EGFR信号通路、TGF—β信号通路、Sonic hedgehog信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路等在动物发育中起重要作用的信号通路,都在肿瘤中发现了突变。“控制脊椎动物胚胎发育的信号通路可能与人类肿瘤的发生有关”这一观点的提出,为肿瘤发生机制的研究提供了新的方向。Sonic hedgehog信号通路是人类胚胎发育过程中调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路。Sonic hedgehog信号通路主要由分泌型信号糖蛋白Sonichedgehog（Shh）配体、跨膜蛋白受体patched（Ptc）和另一跨膜蛋白smoothened（Smo）组成的复合物,以及下游转录因子Gli蛋白（Gli1、Gli2、Gli3）组成。近年来,研究发现人类多种肿瘤的发生发展与Sonic hedgehog信号通路的异常激活密切相关。如在基底细胞癌、小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、髓母细胞瘤、胃癌、食道癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤中均可发现Sonic hedgehog信号通路关键成员的突变或异常表达。同样在结直肠癌组织中也发现了Sonic hedgehog信号通路的关键成员Shh、Ptc的高表达,体外细胞实验提示外源性Shh能促进结肠上皮细胞和肿瘤细胞的增殖,而抗Shh抗体能抑制结肠上皮细胞和肿瘤细胞的增殖。综观以往有关结直肠癌与Sonic hedgehog信号通路异常激活的研究,均着重于对Shh配体的作用研究,对于Sonic hedgehog信号通路中其它成员的研究较少。Smo蛋白是Sonic hedgehog信号通路的关键成员,对信号通路具有激活作用。有关Smo基因在结直肠癌发生中的作用,目前尚未见研究报道。本课题拟应用Western blot及半定量RT-PCR技术检测结肠腺癌Lovo细胞内Smo基因的表达水平,探讨Smo基因与结直肠癌的关系,再应用RNAi技术通过转染体外合成的特导性Smo siRNA进入Lovo细胞内降解Lovo细胞内的Smo mRNA表达,最后应用MTT法、流式细胞术检测Smo mRNA被降解后Lovo细胞增殖水平与凋亡水平的变化,探讨Smo基因在结直肠癌中的作用。目的探讨Smo基因与结直肠癌的关系,以及Smo基因在结直肠癌中的作用,为Smo基因位点上阻断Sonic hedgehog信号通路靶向治疗结直肠癌提供实验依据。材料与方法1、细胞来源:本实验所使用的结肠腺癌Lovo细胞株购于中山大学实验动物中心。主要试剂:总RNA提取试剂异硫氰酸胍（Trizol）、RT-PCR试剂盒（FSK-100）、兔抗人Smo浓缩型多克隆抗体0.1ml、辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体（二抗）、碘化丙啶（PI）、Annexin-Ⅴ凋亡检测试剂盒、MTT等。主要设备:CO2恒温孵育箱、Epics Altra型流式细胞仪、PCR扩增仪、DYY-40B转印电印电泳槽、DYY-B型电泳仪。2、实验方法:（1）Lovo细胞株于含10%胎牛血清、1%链霉素、青霉素的RPMI1640培养基,置于37℃,5%C02孵箱中培养,保持饱和湿度;（2）半定量RT-PCR测定结肠腺癌Lovo细胞的Smo mRNA表达;（3）Western blot印迹检测结肠腺癌Lovo细胞的Smo蛋白表达;（4）设计并体外化学合成3对SmosiRNA:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3,及1对非特异性siRNA;（5）将Lovo细胞分成A、B、C、D、E五组:A组为转染特异性siRNA-1组,B组为转染特异性siRNA-2组、C组为转染特异性siRNA-3组,D组为阳性对照组（转染非特异性siRNA）,E组为阴性对照组（转染时只加Lipofectamine,不加任何siRNA）,每组设6个重复孔。（6）利用阳性脂质体转染方式分别将Smo siRNA转染入各组Lovo细胞内;（7）半定量RT-PCR测定转染后48小时各组Lovo细胞的Smo mRNA表达,比较3对Smo siRNA抑制Lovo细胞Smo mRNA表达的效果,筛选出抑制Lovo细胞Smo mRNA表达最有效的siRNA,后继实验中均以该特异性siRNA转染的细胞为实验组;（8）再将Lovo细胞分成实验组、阳性对照组、阴性对照组,每组设6个重复孔进行转染;（9）MTT法检测转染后12h、24h、36h、48h、72h各组Lovo细胞的增殖水平;（10）流式细胞术检测转染48h后各组Lovo细胞的凋亡率。3、统计学分析:所有数据采用SPSS11.5软件进行统计分析。转染后不同组Smo基因mRNA水平的比较用完全随机资料方差分析（One-way ANOVA）,不同时间点不同组Lovo细胞增殖水平的比较用重复测量方差分析,若P＜0.05组间差异有统计学意义时,则进一步行LSD多重比较。不同组细胞凋亡率比较用独立样本率的χ2检验。结果1、Western blot及半定量RT-PCR检测结肠腺癌Lovo细胞内Smo蛋白及Smo mRNA的表达水平,结果发现结肠腺癌Lovo细胞内有Smo蛋白及SmomRNA的高表达。2、转染48h后,siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组及阳性对照组与阴性对照组的Lovo细胞的Smo mRNA表达水平有显著性差异（F=891.496,P＜0.001）,siRNA-1组Smo mRNA表达水平最低,siRNA-2组次之,两组分别与阴性对照组比较,差异均有显著性（P＜0.001）;而siRNA-3组、阳性对照组与阴性对照组比较,差异无显著性（P＞0.05）;siRNA-1组与siRNA-2组比较,差异亦有显著性（P＜0.001）。siRNA-1组、siRNA-2组的抑制率分别为63.56%、46.54%,siRNA-3组无抑制作用,后续实验选择siRNA-1转染Lovo细胞作为实验组。3、于转染后12、24、36、48、72 h不同时间点,siRNA-1组、阳性对照组及阴性对照组的Lovo细胞的增殖水平有显著性差异（F=359.299,P＜0.001）,siRNA-1组Lovo细胞的增殖水平在不同时间点均显著低于阴性对照组（P＜0.05）。4、于转染48h后,siRNA-1组、阳性对照组及阴性对照组的Lovo细胞的凋亡率分别为21.7%、10.1%、4.4%,siRNA-1组细胞凋亡率较阳性对照组和阴性对照组显著升高,差异具有统计学意义（χ2=15.909,P＜0.001）结论（一）结肠腺癌的发生与Smo基因的高表达有关。（二）Smo基因的高表达与结肠腺癌Lovo细胞的增殖与凋亡异常有关;Smo基因可能作为一个癌基因在结肠腺癌发生过程中发挥着作用。（三）应用Smo siRNA介导RNAi降解结肠腺癌Lovo细胞内的Smo mRNA是有效可行的。（四）在Smo基因位点上阻断Sonic hedgehog信号通路可能是结直肠癌生物治疗一个新的靶点。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• Smoothened（Smo） siRNA对结肠腺癌Lovo细胞Smo基因表达及细胞增殖与凋亡的影响
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 中英文对照缩略词表
• 综述
• 硕士研究生期间以第一作者发表的论文
• 研究生毕业论文统计学审稿证明
• 致谢