hNPFF2受体细胞模型的建立及其信号转导的研究

论文摘要

人们在许多软体动物中鉴定出一种多肽,即FMRFamide,并用抗FMRFamide的抗血清在牛脑中枢神经系统中分离出两种内源表达的多肽,一个是八肽——神经肽FF,另一个是十八肽——神经肽VF。神经肽FF在中枢神经系统和外周组织中具有许多功能。神经肽FF发挥其药理学功能,是因为它们能够与两种G-蛋白偶联受体相互作用,这两种受体是NPFF1和NPFF2受体。在几种表达这两种受体的细胞系中,已证实它们都是与Gi/o相偶联的受体,例如CHO、HEK293、SH-SY5Y。经过对NPFF和NPFF2受体的分析实验结果,以及药理学和生理学的实验数据,表明NPFF2受体是NPFF的主要受体。SK-N-SH（人神经母细胞瘤细胞）和SK-N-MC（人神经上皮瘤细胞）是Biedler分别在1970年和1971年建立起来的两种神经组织来源的细胞系。2006年Panula等人发现在SK-N-MC中内源表达NPFF和hNPFF2受体,而且NPFF类似物（1DMe） NPYF能够激活MAPK级联反应。然而,SH-SY5Y是从SK-N-SH中衍生而来的亚细胞系,这是否暗示出在SH-SY5Y中也可能内源表达hNPFF2受体,并且hNPFF2受体能够在该细胞中激活MAPK级联反应。因此,我们用RT-PCR和基因测序的方法鉴定出了在SH-SY5Y细胞中确实有内源的hNPFF2受体的表达。此外,我们还用不同浓度的NPFF作为激动剂处理细胞,发现可以激活MAPK级联反应。NPFF浓度在0.1μM时就已使ERK1/2发生显著的磷酸化,10μM达到最高值。这在功能上证明了hNPFF2受体在SH-SY5Y细胞中的天然表达,还验证了hNPFF2受体被活化后是可以激活ERK1/2信号通路的。有研究证明GPCRs能够激活Akt信号通路,如μ-和δ-阿片受体也能够激活Akt信号通路,并且MAPK和Akt信号通路之间有相互作用。所以我还用NPFF处理细胞,产生剂量依赖的激活Akt信号通路,因为NPFF可以诱导Akt（T308）发生磷酸化。但是,NPFF在100μM的浓度时能使Akt （Thr308）发生显著的磷酸化。这就证明了hNPFF2受体活化后还可以激活Akt信号通路。为了能够更好的研究hNPFF2受体所介导的细胞信号事件,我们还构建了一个稳定表达细胞模型pCDNA3.1（+）-HA-hNPFFR2-HEK293,和一个瞬时表达细胞模型pECFP-C1-HA-hNPFFR2-Hela。总之,我们在SH-SY5Y细胞中鉴定出有hNPFF2受体的天然表达,并且验证了hNPFF2受体被活化后是可以激活MAPK和Akt级联反应。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 神经肽FF及其受体的发现
• 1.1.1 RFa家族的发现
• 1.1.2 神经肽FF和神经肽AF的发现
• 1.1.3 神经肽FF前体的鉴定
• 1.1.4 神经肽FF受体的发现
• 1.2 神经肽FF和神经肽FF受体的组织分布
• 1.2.1 神经肽FF的组织分布
• 1.2.2 神经肽FF受体的组织分布
• 1.3 NPFF系统的主要生理功能
• 1.4 对NPFF受体在细胞水平上的研究进展
• 1.5 NPFF系统和NO之间的关系
• 1.6 SH-SY5Y细胞的来源
• 1.7 MAPK（ERK1/2）与PI3K-Akt信号通路
• 1.7.1 MAPK（ERK1/2）信号通路
• 1.7.2 PI3K-Akt信号通路
• 第二章 立题依据
• 第三章 材料与方法
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 多肽的合成方法和纯化方法
• 3.2.1 试剂处理
• 3.2.2 NPFF的固相合成
• 3.2.3 切割树脂
• 3.2.4 多肽分离纯化和鉴定
• 3.3 用Western blot方法检测ERK1/2和Akt信号通路
• 3.3.1 试剂配制
• 3.3.2 蛋白样品制备
• 3.3.3 用BCA测定蛋白样品浓度
• 3.3.4 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳
• 3.3.5 转印
• 3.3.6 封闭和抗体孵育
• 3.3.7 ECL显色和压片
• 3.3.8 用Stripping buffer再生膜
• 3.4 重组载体构建
• 3.4.1 重组载体的构建策略
• 3.4.2 引物设计
• 3.4.3 目的基因的扩增
• 3.4.4 目的基因的克隆
• 3.4.5 Inoue法制备超级感受态细胞
• 3.4.6 转化
• 3.4.7 阳性克隆的鉴定
• 2重组质粒'>3.4.8 构建pcDNA3.1（+）-HA-NPFFR₂重组质粒
• 2重组质粒'>3.4.9 构建pECFP-C1-HA-NPFFR₂重组质粒
• 3.5 细胞模型的建立
• 3.5.1 制备高纯度、高浓度质粒
• 3.5.2 筛选最小抗性浓度
• 3.5.3 转染
• 3.5.4 重组细胞的鉴定
• 3.6 数据分析
• 第四章 实验结果
• 4.1 在SH-SY5Y细胞系中内源表达hNPFF2受体
• 4.2 hNPFF2受体在SH-SY5Y细胞中介导的MAPK信号通路
• 4.3 hNPFF2受体在SH-SY5Y细胞中介导的Akt信号通路
• 2载体和pECFP-C1-HA-NPFFR₂载体'>4.4 pCDNA3.1（+）-HA-NPFFR₂载体和pECFP-C1-HA-NPFFR₂载体
• 2载体的构建'>4.4.1 pCDNA3.1（+）-HA-NPFFR₂载体的构建
• 2载体的构建'>4.4.2 pECFP-C1-HA-NPFFR₂载体的构建
• 2和Hela-NPFFR₂的细胞模型建立'>4.5 表达有HEK293-NPFFR₂和Hela-NPFFR₂的细胞模型建立
• 2-HEK293细胞模型'>4.5.1 稳定表达pCDNA3.1（+）-HA-NPFFR₂-HEK293细胞模型
• 2-Hela细胞模型'>4.5.2 瞬时表达pECFP-C1-HA-NPFFR₂-Hela细胞模型
• 第五章 讨论
• 2受体表达的调节'>5.1 ERK对hNPFF₂受体表达的调节
• 2受体的细胞功能'>5.2 Akt信号通路可能参与了hNPFF₂受体的细胞功能
• 2受体的细胞模型的意义'>5.3 构建表达hNPFF₂受体的细胞模型的意义
• 5.4 总结
• 参考文献
• 在学期间的研究成果
• 致谢
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ