狐貉源犬瘟热病毒分离株F基因序列分析及H、F、N基因联合免疫小鼠诱导的免疫应答

论文摘要

犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的多种动物急性、高度接触性传染病,是毛皮动物人工养殖中经常发生的重要病毒性传染病之一,一旦流行,死亡率达30%～100%。这不但给毛皮动物养殖场（户）造成了严重的经济损失,且严重地影响和制约整个产业的快速发展。目前常规弱毒疫苗的广泛使用,虽然使CD得到了较好的预防和控制,但是也存在诸多缺点。比如,弱毒苗多容易受母源抗体的干扰;可能有毒力返强的危险;弱毒苗对于部分野生动物也是不安全的;特别是近年来CDV的不断变异和野毒株的出现,使得弱毒苗不能够提供完全的保护。因此研究CDV的遗传变异规律,研制新一代安全、高效的CD基因工程疫苗,对犬瘟热的有效防控是具有极其重要的现实意义的。本研究从黑龙江地区饲养场发病狐、貉中分离获得6株犬瘟热病毒（CDV）,分别命名为MS01、SC01、ZD01、GN01、HL01、NM01分离株。根据Genbank上发表的的CDV F基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR方法分别对6个分离株F基因进行克隆、测序,并推导其氨基酸序列,绘制出F基因的遗传进化树。结果表明:6个CDV分离株F基因的开放阅读框架（ORF）均为1989bp,编码663个氨基酸,蛋白结构中的13个Cys残基位点和4个潜在的糖基化位点均高度保守,其裂解位点的氨基酸序列为220R-R-Q-R-224R。遗传进化分析表明:6个分离株与CDV代表强毒株A75/17属于同一谱系,均为强毒株。其中,HL01株与海豹瘟热病毒2型（PDV-2）亲缘关系较近,与其它5个分离株关系相对较远。进一步选择其中代表性较强的MS01分离株,将其全长F基因插入真核表达载体pcDNA3.1+,并通过酶切和PCR技术在DNA水平上对其进行鉴定,表明成功构建了pcDNA-F真核表达质粒。将所构建重组质粒pcDNA-F与实验室保存质粒pcDNA-H和pcDNA-N联合免疫小鼠,结果表明:3个基因混合免疫组其CD4+T和CD8+T细胞的百分含量明显高于单基因和双基因免疫组,接近于弱毒疫苗组CD4+T和CD8+T淋巴细胞的百分含量。血清中能检测出特异性抗CDV抗体。表明H、F、N基因的重组质粒DNA免疫小鼠可以诱导产生特异性细胞免疫和相应的体液免疫。为下一步动物试验以及针对毛皮动物犬瘟热病毒感染的DNA疫苗的研制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 CD 病原学
• 1.2.2 CDV 分子生物学
• 1.2.3 CD 流行特征
• 1.2.4 CDV 基因工程疫苗
• 1.3 本研究课题的目的及意义
• 2 狐貉源犬瘟热病毒 F 基因的克隆与序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 毒株来源
• 2.1.2 实验试剂和仪器
• 2.1.3 F 基因的克隆
• 2.1.4 序列测定
• 2.1.5 序列比较分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 RT-PCR 电泳结果
• 2.2.2 六株 CDV F 基因的亚克隆和阳性重组质粒的鉴定
• 2.2.3 六株 CDV F 基因的阳性重组质粒的测序结果
• 2.2.4 CDV F 基因的同源性比较
• 2.2.5 CDV F 基因和蛋白系统进化树分析
• 2.2.6 CDVF 基因和蛋白遗传位点分析
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 3 CDV MS01分离株 F 基因真核表达载体的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 病毒株
• 3.1.2 实验试剂和仪器
• 3.1.3 引物的设计与合成
• 3.1.4 CDV MS01株 F 基因的克隆
• 3.1.5 F 基因真核表达载体的构建
• 3.1.6 重组真核表达质粒的鉴定
• 3.1.7 犬瘟热 F 基因 DNA 疫苗质粒的大量制备及纯化
• 3.2 结果
• 3.2.1 CDV MS01株 F 基因的扩增
• 3.2.2 CDV MS01株 F 基因扩增产物的单、双酶切和回收结果
• 3.2.3 重组真核表达质粒的鉴定
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 4 CDV MS01分离株 H、F、N 基因疫苗免疫小鼠诱发的免疫应答水平的检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 DNA 免疫
• 4.1.4 免疫小鼠外周血 T 淋巴细胞亚类 CD4+和 CD8+检测
• 4.1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中抗 H、F 和 N 抗体
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 基因疫苗免疫小鼠外周血 CD4+和 CD8+检测
• 4.2.2 ELISA 检测小鼠血清中抗 H、F 和 N 抗体
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小节
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢