论文摘要
水稻籼粳杂种具有强大的杂种优势,但籼粳杂种的低温敏感性是限制其利用的因素之一。以17个不同类型的籼、粳、爪哇型品种及其杂种为材料,通过分期播种,研究了温度变化对花粉育性的影响。结果表明,当花粉母细胞减数分裂期的日平均气温低于22-23℃时,亚种间杂种的花粉育性显著降低,不同组合花粉育性存在明显差异,而品种间杂种和常规品种的花粉育性受影响较小;当花粉母细胞减数分裂期的日平均气温低于20℃时,常规品种和品种间杂种的花粉发育也受到不同程度的影响,不同品种与组合间存在差异。花粉母细胞减数分裂期的日平均温度与花粉育性的相关性分析表明,温度与亚种间杂种花粉育性呈显著正相关。说明减数分裂期的亚种间杂种花粉育性受温度影响,温度对亚种间杂种花粉育性的影响较常规品种大.为探明籼粳杂种低温花粉不育的遗传基础,以籼稻品种3037和粳型广亲和品种02428的F2分离群体进行了低温花粉不育的遗传分析。通过推迟播种调节抽穗期后,F2群体花粉母细胞减数分裂期的日平均温度为21～23℃,调查了F2群体各单株的花粉育性。利用108对SSR引物构建了包含157个F2单株,覆盖12条染色体的分子标记连锁图谱。该连锁图的总长度为1857.8 cM,标记间平均距离为16.26 cM。采用区间作图法对F2群体花粉不育性进行QTL分析,共检测到2个低温花粉不育QTL,即qLTSPS2和qLTSPS5,分别位于第2、5染色体,其加性效应分别为0.021、0.045,显性效应分别为-0.246、-0.251,显性度分别为11.7和4.8,具有超显性效应,分别解释表型变异的15.6%、11.9%。两因素的方差分析表明这两个QTL之间不存在互作。利用强耐冷品种日本晴和不耐冷品种Kasalath及其衍生的98个（Nipponbare/Kasalath∥Nipponbare）回交重组自交家系（BILs）进行了水稻芽期耐冷性数量性状基因座的检测和遗传效应分析。25℃正常条件下水稻发芽7d,芽长5-10mm,5℃低温处理10d,之后升温至25℃,缓苗10d,调查活苗率,并以活苗率作为芽期耐冷性的表型值,分析亲本和98个BILs的芽期耐冷性表现。采用复合区间作图法,共检测到4个芽期耐冷性QTL,分别位于第3、第7和第12染色体上,命名为qSCT-3-1、qSCT-3-2、qSCT-7和qSCT-12。4个QTL的LOD值分别为3.51,3.68,2.03和3.61,可解释群体表型变异的12.11%,12.66%,6.82%和15.86%。在第3染色体检测到的qSCT-3-1与前人检测到的耐盐QTL在同一区间,qSCT-3-2与前人检测到的低温发芽QTL在同一区间。通过生物信息学的方法发现在第3染色体qSCT-3-1所在区域存在一个KS型脱水蛋白。利用RT-PCR方法,从水稻中克隆了该KS型脱水蛋白基因（Osdhn2,GenBank登录号:D26538）。对克隆的Osdhn2基因的生物信息学分析表明:其亲源关系与茄子的脱水蛋白更近,Osdhn2编码蛋白与茄子的脱水蛋白同源性达86%;而与大麦和小麦的KS型蛋白基因同源性67%。序列分析表明Osdhn2编码蛋白具有两个脱水蛋白保守的结构域,即一个富含赖氨酸片段（K片段）和一个丝氨酸片段（S片段）。进一步分离克隆了Osdhn2的基因组DNA,Osdhn2基因具有1个完整的外元,1个内元位于3’端非编码区。组织表达谱分析表明,Osdhn2在幼苗的根中低表达,在未成熟胚、幼穗、叶片、茎中都有表达,盐胁迫后根中表达增加。定量PCR表明Osdhn2在雌蕊中高表达,而在花药中低表达,开花授精后,在种子中表达迅速降低。定量PCR表明在干旱和低温胁迫处理后,其表达显著增强。利用PCR克隆了9311和Kasalath的Osdhn2基因及其上游约800bp启动子序列,对其进行了序列比较,发现9311在该区域与日本晴不存在序列差异,而Kasalath在启动子上游557bp处存在一个碱基的差异。为进一步研究该启动子组织表达特性,从日本晴克隆了1.3kb的启动子序列,构建了Osdhn2基因启动子GUS转基因表达载体,目前已获得转基因幼苗。将Osdhn2基因克隆到原核表达载体pET32a（+）系统,诱导基因表达,携带有Osdhn2的大肠杆菌在800mmol/LNaCl或700mmol/L KCl或4℃处理后其生长速度明显快于对照。这表明,携带水稻KS型脱水蛋白的大肠杆菌可以提高大肠杆菌耐低温和耐盐能力。为分析Osdhn2基因的功能,我们构建了Osdhn2基因的CaMV35S驱动的过量表达载体,并转化芽期不耐冷的籼稻品种Kasalath,转基因T1代种子经潮霉素抗性筛选和PCR鉴定后,对阳性株系芽期耐冷性鉴定,发现其芽期耐冷能力明显好于野生型,初步说明KS型脱水蛋白基因与水稻耐冷性有关;在200mM NaCl溶液中发芽和生长3周后,转基因株系耐盐能力也明显提高。为了功能互补分析,我们构建了该基因的RNA干扰载体,并以玉米Ubiquitin启动子驱动,目前已获得转基因幼苗。