海参肠乙酰胆碱酯酶的提取、纯化及其特性研究

2020-12-11阅读(221)

论文摘要

采用含01% Triton X-100的PBS缓冲液（0.1mol/L, pH7.4）分别从海参肠及体壁中提取获得AChE粗酶,结果表明,海参肠与体壁AChE粗酶具有相似的酶学性质,其最适反应pH值为8.0,pH在6-9时稳定；最适反应温度为35℃左右,在25-40℃内热稳定性较好。海参AChE粗酶液能有效水解碘化硫代乙酰胆碱（AcSChI）,但对碘化硫代丁酰胆碱（BuSChI）的作用较弱。当AcSChI浓度大于50 mmol/L时,产生明显的底物过量抑制效应。Sn2+、Zn2+、Hg2+、Ag+、Cr6+、Cu2+及毒扁豆碱和BW284c51均对海参肠和海参体壁AChE粗酶有不同程度的抑制作用。采用紫外照射30 min后室温静置的方法诱导海参肠自溶,对其自溶前后AChE的酶活变化进行研究,发现自溶前后AChE酶活无显著变化。在紫外照射30 min,室温静置4h条件下,通过考察AChE抑制剂毒扁豆碱对海参肠自溶过程中TCA可溶性蛋白溶出速率的影响,发现毒扁豆碱可显著促进海参肠的自溶程度,表明AChE对海参肠自溶可能具有一定的抑制作用。从海参肠中提取的AChE粗酶液经DEAE-52阴离子交换层析、Sepharose CL-6B凝胶层析,纯化倍数达35.49倍,S DS-PAGE测定显示一条带,分子量约为68 kDa。测得该酶的最适反应pH值为7.5,pH在6-8时稳定；最适反应温度为35℃左右,25～40℃内热稳定性较好。其特异性底物为AcSChI,水解该底物的Km值为0.62 mmol/L。当AcSChI浓度大于0.8mmol/L时产生明显的底物过量抑制效应。毒扁豆碱和BW284c51对纯化后的酶有明显的抑制作用,iso-OMPA对酶的抑制作用较弱。以3-羧基苯基-乙基二甲基铵为配基,与溴化氰活化琼脂糖凝胶交联制备亲和层析柱,分离海参肠中AChE,对其洗脱条件进行优化。结果显示,其适宜的平衡体系为含0.3mol/L NaCl的PBS （0.05 mol/L, pH7.4）缓冲液,适宜洗脱体系为含0.2mol/L四乙基碘化铵的P BS（0.05 mol/L, pH7.4）缓冲液。此条件下,海参肠AChE可得到较好的吸附和分离。初步纯化后的AChE经Native-PAGE电泳分离出三条具有酶活性的条带,说明AChE在海参肠内可能以多种形式存在,呈现多态性。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 海参

1.1.1 海参概述

1.1.2 海参的种类和分布

1.1.3 海参的营养与功效

1.1.4 海参的自溶

1.1.5 海参内源酶的研究进展

1.2 乙酰胆碱酯酶（AChE）概述

1.2.1 AChE的结构特点

1.2.2 AChE的反应特点及机理

1.2.3 AChE的分子存在形式

1.2.4 AChE的功能及应用

1.3 AChE分离纯化的研究进展

1.3.1 AChE的来源

1.3.2 AChE的分离纯化方法

1.3.3 昆虫来源AChE的分离纯化

1.3.4 植物来源AChE的分离纯化

1.3.5 动物来源AChE的分离纯化

1.4 本论文研究的意义及主要内容

第二章海参乙酰胆碱酯酶粗酶的特性研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 主要实验仪器

2.2.3 主要实验试剂

2.3 实验方法

2.3.1 海参AChE粗酶的提取

2.3.2 蛋白质含量的测定

2.3.2.1 考马斯亮蓝G-250染色法测蛋白质含量

2.3.2.2 Lowry法测定蛋白质含量

2.3.3 AChE活性的测定

2.3.4 AChE粗酶的特性分析

2.3.4.1 最适反应pH的确定

2.3.4.2 最适反应温度的确定

2.3.4.3 pH稳定性的确定

2.3.4.4 酶热稳定性的确定

2.3.4.5 底物浓度对酶的影响

2.3.4.6 底物特异性的研究

2.3.4.7 金属离子对酶的影响

2.3.4.8 抑制剂对酶的影响

2.3.5 AChE在海参肠自溶中的作用分析

2.3.5.1 AChE在海参肠自溶前后的变化

2.3.5.2 AChE抑制剂对海参自溶的影响

2.4 结果与讨论

2.4.1 海参AChE粗酶性质的研究

2.4.1.1 海参AChE粗酶的最适反应pH

2.4.1.2 海参AChE粗酶的最适反应温度

2.4.1.3 海参AChE粗酶的pH稳定性

2.4.1.4 海参AChE粗酶的热稳定性

2.4.1.5 底物浓度对海参AChE粗酶的影响

2.4.1.6 海参AChE粗酶的底物特异性

2.4.1.7 金属离子对海参AChE粗酶的影响

2.4.1.8 抑制剂对海参AChE粗酶的影响

2.4.2 AChE在海参自溶过程中的作用

2.4.2.1 AChE在海参肠自溶前后的变化

2.4.2.2 AChE抑制剂对海参肠自溶的影响

2.5 本章小结

第三章海参肠乙酰胆碱酯酶的纯化及其特性研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 主要实验仪器

3.2.3 主要实验试剂

3.3 实验方法

3.3.1 海参肠AChE粗酶的提取

3.3.2 考马斯亮蓝G-250染色法测蛋白质含量

3.3.3 AChE活性的测定

3.3.4 海参肠AChE的分离纯化

3.3.4.1 DEAE-52阴离子交换层析

3.3.4.2 Sepharose CL-6B凝胶层析

3.3.5 SDS-PAGE电泳

3.3.6 海参肠AChE酶学特性研究

3.3.6.1 最适反应pH的确定

3.3.6.2 最适反应温度的确定

3.3.6.3 pH稳定性的确定

3.3.6.4 酶热稳定性的确定

3.3.6.5 底物特异性及反应动力学的研究

3.3.6.6 抑制剂对酶活力的影响

3.4 结果与讨论

3.4.1 海参肠AChE的分离纯化

3.4.1.1 DEAE-52阴离子交换层析

3.4.1.2 Sepharose CL-6B凝胶层析

3.4.2 海参肠AChE的纯化结果分析

3.4.2.1 纯化倍数及得率

3.4.2.2 SDS-PAGE对分子量的测定

3.4.3 海参肠AChE的酶学特性

3.4.3.1 酶的最适pH

3.4.3.2 酶的最适反应温度

3.4.3.3 酶的pH稳定性

3.4.3.4 酶的热稳定性

3.4.3.5 底物特异性的研究

3.4.3.6 抑制剂对酶活力的影响

3.5 本章小结

第四章海参肠乙酰胆碱酯酶亲和层析洗脱条件的优化

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 主要实验仪器

4.2.3 主要实验试剂

4.3 实验方法

4.3.1 海参肠粗酶的提取

4.3.2 AChE活性的测定

4.3.3 DEAE-52阴离子交换层析

4.3.4 亲和层析

4.3.4.1 CEA亲和柱的制备

4.3.4.2 亲和层析洗脱条件优化

4.3.5 电泳分析

4.3.5.1 SDS-PAGE电泳

4.3.5.2 Native-PAGE电泳

4.3.5.3 活性染色

4.4 结果与讨论

4.4.1 亲和层析洗脱条件优化

4.4.1.1 离子强度对吸附效果的影响

4.4.1.2 洗脱液的选择对分离效果的影响

4.4.1.3 样品纯度对分离效果的影响

4.4.2 电泳分析

4.5 本章小结

第五章结论

参考文献

致谢

附录A

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