原子力显微镜对氧化应激人脐静脉内皮细胞膜表面超微结构的研究

论文摘要

目的:利用氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）发生脂质过氧化,建立氧化应激模型。研究内皮细胞从功能受损进展到结构改变的规律和特点,并试图完成细胞间黏附分子-1（ICAM-1）在内皮细胞表面的结构重现。方法:以0.1%I型胶原酶37℃消化15-20min人脐静脉内皮,分离获得的原代HUVEC用低血清内皮细胞专用培养基重悬,37℃、5%CO2孵箱内培养至融合后传代;用VIII因子相关抗原鉴定内皮细胞,将第2-3代细胞用于实验。将细胞传代,以一定的密度接种入培养板或塑料培养皿,使其于24小时内贴壁生长,并达80%融合;以终浓度为100μg/ml的氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）与HUVEC共同培养,按培养时间的不同分为0h、4h、8h、16h四实验组,各组内设对照组,以等体积磷酸盐缓冲液（PBS）代替ox-LDL。MTT比色法比较四组细胞增殖活性;取细胞上清液比较四组细胞NO的含量以判断HUVEC的功能状态;应用原子力显微镜（AFM）观察各组贴壁HUVEC表面超微结构;选取0和16小时实验组细胞进行ICAM-1免疫胶体金标记,在AFM下通过寻找金颗粒,对ICAM-1分子进行定性,从而在内皮细胞表面重现ICAM-1分子。结果1 8h实验组活HUVEC数量低于0h实验组（P<0.05）,16h实验组活细胞数较0h、4h、8h实验组进一步减少（P<0.05）。16h对照组活细胞数较0h、4h、8h对照组增加（P<0.05）。8小时后实验组细胞数低于同期对照组（P<0.05）。2 8h实验组NO含量低于0h和4h实验组（P<0.05）;16h实验组NO含量较8h实验组进一步降低（P<0.05）。四对照组NO含量无显著性差异（P>0.05）。8小时后实验组NO含量低于同期对照组（P<0.05）。3 4h实验组HUVEC表面颗粒开始聚集,分布出现紊乱,大的突起开始出现,且高于0h实验组;8h实验组与0h、4h实验组相比表面突起更加明显,出现少量孔洞;16h实验组与0h、4h、8h实验组相比,突起显著增多,且出现较多空洞。0h、4h、8h及16h实验组粗糙度分别为13.666±2.196nm、15.904±2.203nm、17.688±2.076nm、21.609±1.867nm,两两相比均存在显著性差异（P<0.05）;0h、4h、8h及16h对照组粗糙度分别为13.627±2.218nm、13.659±2.183nm、13.665±2.175nm、13.974±2.478nm,两两相比无显著性差异（P>0.05）;4小时后实验组粗糙度高于同期对照组（P<0.05）。4金标记二抗分子中的金颗粒在AFM Phase相图片中表现为无拖尾的高亮斑,大小为21.548±1.692nm,对应的Height相图片中可见对应的二抗分子,表现为类圆形颗粒,大小为50.944±4.404nm。5 0h实验组细胞经胶体金标记后,AFM Phase相中仅见少量高亮斑,大小为53.826±5.367nm,与金标记二抗涂片的Phase相中高亮斑相比,存在显著性差异（P<0.01）;对应的Height相中无对应的类圆形颗粒。16h实验组细胞Phase相中可见较多高亮斑,大小为21.355±1.905nm,与金标记二抗涂片的Phase相中高亮斑相比,无显著性差异（P>0.05）,对应Height相中对应位置可见类圆形颗粒,大小为51.610±4.752nm,与金标记二抗涂片的Height相中类圆形颗粒相比,无显著性差异（P>0.05）。6对胶体金标记的16h实验组细胞Height相进行三维重建,可见半球形的金标二抗,与之比邻处为形态不规则的突起,似山峰状,平均大小为170nm×220nm,Z轴上平均高度为22±2.326nm。结论1 ox-LDL可抑制HUVEC的增殖活性,减少活细胞数目,致HUVEC的功能减退,呈时间依赖性。2在氧化应激过程中,HUVEC表面超微结构在较早期就发生了改变,并随时间推移呈现动态变化。3 HUVEC表面增多的颗粒中存在ICAM-1成份,其抗原抗体复合物在细胞表面似山峰状。AFM结合免疫胶体金标记技术,在对细胞表面成份的定性分析、形态描述等方面具有可行性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
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• 研究论文 原子力显微镜对氧化应激人脐静脉内皮细胞膜表面超微结构的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 原子力显微镜在细胞实验中的应用
• 致谢
• 个人简历