LQT2综合征与HERG通道基因突变的细胞电生理研究

论文摘要

长QT间期综合征（long Q-T syndrome,LQTS）是指心电图上QT间期延长，伴有T波和（或）u波形态异常，常导致恶性室性心律失常（室性心动过速通常为尖端扭转型室速，心室颤动）、晕厥发作或心源性猝死。本研究构建了人类ether--gogo–related基因野生型（human ether--gogo–related gene wild type,HERG-WT）及其突变型（HERG-V535M）的HEK293细胞系异源性表达体系，分析转染HERG-WT和HERG-V535M后HEK293细胞的电生理特征及其门控动力学机制。首先抽取LQTS患者及其8个家系成员的外周血进行DNA测序，发现HERG基因编码区第1605位点发生碱基A→G错义突变，此突变导致第535位氨基酸发生了V535M突变。突变位点发生在电压依赖性钾通道的S4电压感受器上。为进一步研究该突变的意义，我们将pcDNA3.1-HERG-WT和pcDNA3.1-HERG-V535M质粒分别瞬时转染HEK293细胞系，利用磁珠法活体示踪，用全细胞膜片钳技术和动作电位钳技术记录HEK293细胞上HERG电流。全细胞膜片钳技术结果显示HERG-V535M突变使钾通道电流降低，导致心肌细胞复极过度延长，引起QT间期延长；门控动力学结果显示HERG通道基因V535M突变对于通道的激活过程和灭活过程影响较小，但是可以通过使稳态失活电压向超极化方向移动，显著加速通道的稳态失活，同时也可以降低通道的恢复动力，从而降低了电流幅值。本研究结果与LQT2综合征患者及其母亲心电图表现QTc延长一致，进一步证实单个通道的突变可以导致LQT的发生，为临床遗传性心律失常的诊断提供可靠的依据，也为该类疾病的研究提供有益的思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 一、LQT2 的临床资料及 HERG 基因鉴定
• （一） 材料和方法
• 1 病例选择
• 2 基因组 DNA 提取及聚合酶链反应（ PCR）
• 3 PCR 方法及条件
• （二） 结果
• 1 患者家系资料
• 2 基因突变情况
• （三） 讨论
• 二、HEK293 细胞 HERG 通道的表达
• （一） 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• （二） 结果
• 1 HERG-WT 和 HERG-V535M 质粒的转化
• 2 重组质粒的酶切鉴定
• 3 HEK293 细胞的镜下观察
• 4 CD8-Dnyabead M4 50 磁珠法鉴定 HERG 转染阳性细胞
• 5 RT-PCR 检测结果
• （三） 讨论
• 三、HERG-V353M 和 HERG-WT 钾通道功能的检测
• （一） 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• （二） 结果
• 1 HERG-WT 和 HERG-V535M 钾电流
• 2 HERG-WT 和 HERG-V535M 钾电流的电压依赖性
• 3 HERG-WT 和 HERG-V53 5M 激活和失活时间常数的电压依赖性
• 4 HERG-WT 和 HERG-V535M 通道电流的稳态激活曲线
• 5 HERG-WT 和 HERG-V5 35 M 通道电流的稳态失活曲线
• 6 HERG-WT 和 HERG-V535M 钾通道快速失活常数电压依赖性的作用
• 7 HERG-WT 和 HERG-V535M 钾通道快速失活后恢复时间常数电压依赖性
• 8 HERG-WT 和 HERG-V535M 钾通道的整流行特征
• 9 AP 钳记录 HERG-WT 和 HERG-V535M 钾通道
• 1 0 HERG-WT 和 HERG-V535M 激活时间常数的包络实验
• （三） 讨论
• 结语
• 参考文献
• 英文缩略词
• 致谢
• 在学期间公开发表论文情况